Afin de resituer le travail pr´esent´e ici dans son contexte, nous allons pr´esenter bri`evement l’´etat de l’art de la microscopie THG en biologie. Cette technique ´etant r´ecente, les applications qui en ont ´et´e faites sont peu nombreuses et peu avanc´ees au niveau biologique : bien que diff´erentes voies aient d´ej`a ´et´e explor´ees (ou l’aient ´et´e depuis), une grande partie de la caract´erisation des sources et des modes de contraste restait `a faire au d´ebut de ce travail.
1.4.1
D´emonstrations de principe
Les premiers articles sur la microscopie THG appliqu´ee `a la biologie datent de la fin des ann´ees 90, et repr´esentent essentiellement des d´emonstrations de principe sans r´eelle application en bio- logie. Deux groupes ont publi´e quasi-simultan´ement des images de microscopie THG : celui de Y. Silberberg [84, 85] et celui de J. Squier [86, 87]. Les auteurs montrent que des images structurales avec une r´esolution microm´etrique peuvent ˆetre obtenues `a partir de diff´erents ´echantillons (algue verte, neurones en culture, levures) sans que les sources de contraste soient clairement identifi´ees. Les longueurs d’onde d’excitation utilis´ees sont 1.5mm [84,85] ou 1.2 mm [86,87], permettant une
d´etection dans le visible. Dans ces articles, les auteurs utilisent des puissances d’excitation rela- tivement mod´er´ees (15-50 mW), ce qui conduit `a des temps d’acquisition de plusieurs dizaines de seconde pour des images de taille moyenne (300×300 pixels par exemple, soit environ 105 pixels). Les auteurs discutent ´egalement des caract´eristiques des images THG, o`u ressortent princi- palement des structures de taille microm´etrique (organelles) et des interfaces telles que les parois cellulaires. Ceci est confirm´e par l’analyse th´eorique de Cheng et al. [88], qui montrent par des simulations que les conditions d’accord de phase conduisent `a une annulation du signal pour un milieu homog`ene et isotrope et `a l’exaltation de structures de taille comparable `a celle du volume focal.
Un peu plus tard, le groupe de C.K. Sun [79, 89] d´emontre la combinaison des microscopies THG, SHG et 2PEF au niveau de parois cellulaires dans des tiges de ma¨ıs, puis dans un embryon de poisson-z`ebre.
1.4.2
Applications en imagerie structurale
Les premi`eres ´etudes des applications potentielles de la microscopie THG en biologie concer- nent l’imagerie structurale, o`u le signal THG est utilis´e pour obtenir une image r´esolue en trois dimensions des diff´erentes structures dans l’´echantillon, sans grande sp´ecificit´e. Ceci permet entre autres de suivre des mouvements et peut ˆetre exploit´e en biologie du d´eveloppement par exemple : Chu et al. [24, 34] ont ainsi montr´e qu’il ´etait possible de suivre sans marquage le d´eveloppement d’un embryon de poisson-z`ebre depuis les premiers stades (quelques cellules) jusqu’au stade de la larve, sans observer de dommages ni de retard au niveau du d´eveloppement. Dans cette ´etude, la source utilis´ee est un laser chrome-forsterite centr´e autour de 1230 nm, ´emettant des impulsions de 100 fs avec une puissance sur l’´echantillon de 100 mW. Les auteurs combinent le signal THG avec le signal SHG provenant des faisceaux de microtubules lors de la division cellulaire puis des muscles de la larve.
D’autres ´etudes ont ´egalement ´et´e men´ees sur des ´echantillons de peau [90] montrant que la microscopie THG peut ˆetre utilis´ee, ´eventuellement en combinaison avec d’autres techniques, pour d´ecrire la morphologie d’un tissu.
Enfin des ´etudes en polarisation ont ´et´e r´ealis´ees pour extraire des informations sur l’orien- tation des structures donnant le signal THG : dans les articles de Oron et al. [91, 92], les auteurs utilisent les propri´et´es de polarisation de la lumi`ere diffus´ee non lin´eairement pour caract´eriser des cristaux biologiques, tels que des spicules d’oursins ou des cystolithes, assemblages partiel- lement cristallis´es de carbonate de calcium contenus dans les feuilles de certains arbres. Il est possible de cette mani`ere d’obtenir des informations sur le degr´e de cristallisation des objets ´
etudi´es et sur la direction de ces cristaux. D’autres ´etudes ont port´e sur le signal obtenu dans le muscle de souris [93], mais aucune information sur la source du signal THG n’est donn´ee : les auteurs ne tirent donc pas d’information de la d´ependance en polarisation observ´ee.
De fa¸con g´en´erale, ces ´etudes d´emontrent les possibilit´es de l’imagerie THG en biologie ainsi que ses limites (notamment sa faible sp´ecificit´e dans beaucoup de tissus). Cependant, `a ce stade, les images ne sont pas utilis´ees pour extraire ou quantifier un param`etre biologique.
1.4.3
Etudes des sources de signal endog`enes
D’autre part, des ´etudes ont vis´e `a caract´eriser plus pr´ecis´ement les sources de contraste dans les ´echantillons biologiques. C’est notamment le cas des articles de Canioni et al. [94, 95, 96], qui s’int´eressent `a l’imagerie sans marquage des flux calciques par microscopie THG. Les auteurs mesurent les variations de signal THG au niveau de la membrane plasmique de cellules en culture lors de l’ajout de drogues modifiant la concentration cytoplasmique en calcium, et attribuent les variations du signal THG aux changements de concentration calcique de part et d’autre de la membrane. Cependant, aucune ´evaluation quantitative des variations de concentration n’est pr´esent´ee, et ces exp´eriences ne sont confirm´ees par aucune exp´erience in vitro. Nous verrons dans le chapitre 3 que ces variations de signal ne semblent pas ˆetre directement li´ees aux flux calciques, ce qui met en ´evidence la difficult´e de l’interpr´etation de ces signaux.
D’autres auteurs [97, 98] ont tout de mˆeme montr´e que la susceptibilit´e non lin´eaire d’une solution de chlorure de calcium d´ependait de la concentration de cette esp`ece, mais les gammes de concentration mises en jeu dans ces articles sont sup´erieures de plusieurs ordres de grandeur `
a celles cit´ees pr´ec´edemment (quelques mol/L contre au plus quelques centaines de mmol/L en milieu cellulaire).
De leur cˆot´e, Clay et al. [99] ont cherch´e `a caract´eriser les propri´et´es de nombreux compos´es en solution, et notamment l’h´emoglobine selon son degr´e d’oxydation. Les auteurs proposent une ´
etude spectroscopique en fonction de la longueur d’onde d’excitation, d´emontrant l’influence sur l’amplitude du signal THG de r´esonances `a un, deux ou trois photons. A partir de ces donn´ees, les ´etats d’oxydation de l’h´emoglobine peuvent, en th´eorie, ˆetre diff´erenti´es par leur signal THG, d’o`u la possibilit´e de sonder avec cette technique l’oxyg´enation des tissus. Cette ´etude corrobore les travaux de Barzda et al. [100] montrant qu’il est possible, dans des cardiomyocytes, de mesurer un signal corr´el´e `a la distribution des mitochondries (riches en h´emoprot´eines), sans marquage.
Bien que l’application biologique de ces r´esultats soul`eve de nombreuses difficult´es (notam- ment en termes de variation relative de signal et de phototoxicit´e, voir chapitre 4), la quan- tification des propri´et´es de solutions biologiques pour la THG est une ´etape essentielle pour la compr´ehension des sources de contraste dans les tissus. Ces deux derniers articles apportent donc beaucoup pour la caract´erisation des signaux cellulaires.
1.4.4
D´eveloppements techniques
Enfin, quelques articles ont propos´e des am´eliorations techniques de la microscopie THG : a Utilisation de nano-objets m´etalliques Afin d’am´eliorer le signal THG et sa sp´ecificit´e, Yelin et al. [74] proposent l’utilisation de nanoparticules m´etalliques pour marquer les ´echantillons ´
etudi´es. Les auteurs montrent que ces particules, en exaltant localement le champ ´electrique, peuvent ˆetre d´etect´ees s´electivement dans des cellules vivantes ou fix´ees et localis´ees en trois dimensions. Cette d´emonstration a ´et´e compl´et´ee par des ´etudes plus exhaustives notamment de la d´ependance du signal THG avec la taille des particules et avec la longueur d’onde d’excitation [75, 101]. Ces ´etudes sont `a rapprocher de l’utilisation de la THG en microscopie de champ proche [102] pour l’imagerie de cristaux biologiques.
Bien qu’elle limite l’int´erˆet de la microscopie THG, notamment en termes de simplicit´e de pr´eparation des ´echantillons et de non-invasivit´e, l’utilisation d’un marquage exog`ene peut s’a- v´erer utile pour obtenir des informations compl´ementaires `a celles obtenues avec les signaux endog`enes. Ces signaux ont par exemple l’avantage par rapport `a la fluorescence des quantum dots de ne pas clignoter, ce qui permet de suivre les particules continˆument. Cependant, il faut noter qu’aucune ´etude de phototoxicit´e de ce type d’imagerie THG n’a ´et´e publi´ee, de mˆeme qu’aucune application en biologie.
b Imagerie THG sans balayage En conclusion, le groupe de Y. Silberberg s’est int´eress´e `
a la possibilit´e d’effectuer des images THG plein champ tout en conservant une bonne r´esolution axiale. Pour ce faire, les auteurs ont d´evelopp´e une m´ethode de focalisation temporelle de l’impul- sion (temporal focusing) [20] permettant d’obtenir un sectionnement optique par la focalisation temporelle de l’impulsion dans l’´echantillon au niveau du plan focal. Les auteurs illustrent cette technique dans le cas de la microscopie 2PEF et non THG, o`u ils sont limit´es par la puissance d’excitation n´ecessaire (il faut en effet illuminer l’ensemble du champ de vue simultan´ement, contre un point dans le cas de la microscopie `a balayage).
Cependant, cette technique de temporal focusing peut ˆetre combin´ee avec la focalisation du faisceau selon une ligne (ce qui r´eduit le balayage `a une dimension) afin d’obtenir un section- nement ´equivalent `a celui obtenu pour une focalisation `a deux dimensions spatiales du fais- ceau [21, 103] et (si la puissance d’excitation suffisante est disponible) une nette diminution de la dur´ee d’acquisition des images. Dans le cas de la microscopie 2PEF, les auteurs d´emontrent ainsi une acquisition des images `a la cadence vid´eo, avec un sectionnement confocal.