Spéciation du phosphore particulaire et dissous

Le phosphore se trouve dans la colonne d’eau sous deux formes principales : particulaire et dissoute. On définit le phosphore particulaire comme celui retenu sur un filtre (0,22 µm dans notre cas) tandis que le phosphore dissous est celui présent dans le filtrat. L’un et l’autre peuvent comprendre des formes organiques et inorganiques.

Afin de connaître les concentrations du phosphore particulaire et dissous dans la colonne d’eau et sur la base des résultats préexistants des analyses ICP-AES effectuées par D. Jézéquel (données de phosphore total particulaire et dissous), différents volumes ont été filtrés par profondeur en évitant le colmatage de chaque filtre (polycarbonate GTTP Millipore 47 mm, 0,22 µm). Pour les premières expériences effectuées, les dosages des phosphates ont été réalisés avec du molybdate d’ammonium. En milieu acide (H2SO4), ce composé réagit avec les ions orthophosphate pour former un complexe phosphomolybdique de couleur bleue mesurable par spectrophotométrie (λ = 720 nm) après réduction par l’acide ascorbique (Deniges, 1920 ; Murphy et Riley, 1962 ; Golterman et al., 1978). Grâce à cette méthode on détermine la concentration en ions phosphate par comparaison avec les valeurs d’absorbance d’une courbe d’étalonnage réalisée auparavant avec différentes concentrations de phosphate. Cependant, pour des raisons pratiques, le réactif de dosage BIOMOL®Green a finalement été utilisé pour mesurer les concentrations de phosphates pour la plupart des profondeurs. Il s’agit en effet d’une méthode colorimétrique (λ = 620 nm) et quantitative (linéaire entre 5 et 80 µM de phosphate dissous) qui comprend un seul réactif et une seule incubation de 30 min. La réaction est basée sur la formation de complexes entre le composé chimique vert de malachite et les orthophosphates de l’échantillon (Annexe 4).

Pour les profondeurs avec des concentrations inférieures au seuil de détection (5 µM de PO4^3-), des cuves de spectrophotométrie de 10 cm ont été utilisées afin d’augmenter la sensibilité de la mesure. Cependant, cela n’a permis de descendre le seuil de détection qu’à 1 µM de PO4^3- seulement, concentration nettement supérieure à celle de plusieurs profondeurs analysées dans la zone oxique de la colonne d’eau. Par conséquence, une méthode d’analyse alternative avec un seuil inférieur (0,08 µM) a été mise en œuvre : l’analyse AxFlow Quaatro. Il s’agit également d’une méthode colorimétrique (λ = 880 nm) où l’intensité de la coloration bleue est liée à la concentration de phosphates des échantillons. Cette coloration est le résultat d’une part de la réaction des ions phosphate avec des ions molybdène et antimoine présents

108 Chapitre I

dans les réactifs, et d’autre part de leur réduction en présence d’acide ascorbique. Afin que l'échantillon puisse bien circuler dans le circuit des capillaires, cette méthode utilise comme solvant du sodium dodecyl sulfate (SDS).

En somme, quatre protocoles différents ont été appliqués aux échantillons en fonction de la forme de phosphore ciblé : d’abord les protocoles pour les parties totales (TPP et TDP) dont le but final est le même : réduire en orthophosphates les molécules phosphorées (organiques et inorganiques) pour finalement les doser avec une méthode assez sensible ; ensuite, le protocole pour la partie inorganique particulaire (PIP), qui cible seulement les formes inorganiques de phosphore présentes dans les particules collectées sur les filtres afin de les réduire en orthophosphates et les mettre en solution ; finalement, le protocole pour l’analyse du phosphore dissous inorganique (DIP) qui consiste en un dosage direct des orthophosphates en solution. Un schéma expliquant l’étape de filtration et les protocoles développés pour les différentes formes de phosphore est montré dans la Figure C.21.

Figure C.21 : Schéma des différents protocoles appliqués afin de connaître les espèces de phosphore des échantillons.

TPP = particulaire total, PIP = particulaire inorganique TDP = dissous total et DIP = dissous inorganique.

3.5.1   Phosphore particulaire total (TPP)

L’analyse du TPP a été réalisée suivant un protocole adapté de Solórzano et Sharp (1980) et Labry et al. (2013). Des demi filtres ont été humidifiés avec 2 mL d’une solution de MgSO4 0,017 M (qui permet une combustion homogène du filtre) puis ont été séchés pendant 3 h dans une étuve à 95 °C. Ensuite, les demi-filtres ont été incinérés dans un four à 480° C pendant 2 h afin de décomposer les composés organiques.

Le phosphore a été extrait avec 5 mL de HCl 0,2 M dans une étuve à 80° C pendant 30 min. Avant de faire le dosage colorimétrique tous les échantillons ont été filtrés par des filtres seringue 0,22 µm de manière à éliminer les éventuels restes en suspension du filtre.

Finalement, un volume d’échantillon a été dosé selon le protocole du réactif de dosage BIOMOL®Green (Annexe 4).

3.5.2   Phosphore inorganique particulaire (PIP)

Le PIP comprend toutes les molécules d’orthophosphate absorbées sur les particules (microorganismes, minéraux) ainsi que les phosphates constituant les phases minérales phosphatées. Il comprend également les particules inorganiques intracellulaires phosphatées On classifie ces dernières molécules en fonction du nombre de résidus d’orthophosphate (n = PO4^3-) : polyphosphates n ≥ 3, pyro-phosphates n = 2 et orthophosphates n = 1 (Labry et al., 2013).

Des demi-filtres ont été séchés dans une étuve à 50 °C pendant 3 h. Ils ont ensuite été immergés dans 5 mL de HCl 1 M pendant 18 h à température ambiante (Aspila et al., 1976 et Labry et al., 2013). La solution obtenue a été filtrée par des filtres seringue à 0,22 µm afin d’éliminer les restes de filtre et avant de réaliser comme précédemment le dosage avec le réactif BIOMOL®Green.

3.5.3   Phosphore organique particulaire (POP)

Le POP comprend les composés organophosphatés cellulaires : phosphomonoesters (P-sucres, phospholipides, nucleosides monophosphate, acide phytique, phosphoamides,

110 Chapitre I

phosphoprotéines…) ; phosphodiesters (ADN, ARN) ; nucleosides di, tri-phosphate et phosphonates. Il a été obtenu en soustrayant le PIP du TPP : POP = TPP – PIP.

3.5.4   Phosphore dissous total (TDP)

Le TDP comprend toutes les formes de phosphore capables de passer par le filtre de 0,22 µm. Dans le but de connaître sa concentration, un protocole adapté d’après Lin et al. (2012) a été appliqué : 5 mL d’échantillon ont été mélangés à 0,5 mL d’une solution de persulfate de potassium (K2S2O8 50 g/L, pH 1) dans un tube de Téflon spécialement conçu pour éviter la perte de l’échantillon par évaporation. Les échantillons ont ensuite été chauffés dans une étuve à 140 °C pendant 4 h. Tous les tubes ont été vortexés et refroidis à température ambiante avant de doser les phosphates comme précédemment.

3.5.5   Phosphore inorganique dissous (DIP)

Le DIP correspond aux ions orthophosphate en solution. Il représente le phosphore directement disponible pour les microorganismes. Le dosage a été effectué avec le réactif BIOMOL®Green directement sur un certain volume de filtrat (Lin et al., 2012).

3.5.6   Phosphore organique dissous (DOP)

Il comprend les mêmes types de molécules organiques que le POP avec la différence que le DOP représente les molécules non confinées dans des cellules et autres molécules d’origine organique même sans liaisons covalentes avec le carbone dans leur structure telles que les poly-P. Il est obtenu en soustrayant le DIP du TDP : DOP = TDP – DIP.