SI inné et mort cellulaire programmée (PCD)

La mort cellulaire programmée (PCD) (Figure 14) est un processus clé dans les systèmes immunitaires métazoaires et végétaux (Coll et al., 2011; Nagata and Tanaka, 2017). Chez les mammifères, les infections intracellulaires sont contenues et éliminées par des voies moléculaires dédiées déclenchant des réponses de mort cellulaire inflammatoire (Jorgensen et al., 2017). Les modalités de la mort cellulaire programmée peuvent être classées comme « nécrotiques » (c'est-à-dire accompagnées d'une rupture de la membrane et de la libération de matériel intracellulaire) et « non nécrotiques » sans libération du contenu intracellulaire (Ashkenazi and Salvesen, 2014). Parce que l'apoptose métazoaire est le principal exemple de mort cellulaire non-nécrotique, cette dernière est généralement appelée « apoptotique ». Par rapport à l'apoptose, la mort cellulaire nécrotique est moins complexe et beaucoup plus répandue. Étant donné que la mort cellulaire causée par des stress mécaniques, chimiques ou biologiques majeurs est généralement associée à la rupture cellulaire, la nécrose était initialement considérée comme une caractéristique de la mort cellulaire non-programmée et il a fallu longtemps avant que la nécrose non-programmée soit acceptée comme une réalité (Edinger and Thompson, 2004). Chez les animaux, il existe plusieurs types différents de nécrose programmée, parmi lesquels la nécroptose et la pyroptose (Figure 15) sont les exemples les mieux compris et probablement les plus importants (Cookson and Brennan, 2001; Bergsbaken et al., 2009; Vandenabeele et al., 2010).

L'étape cruciale dans l'induction de la mort cellulaire apoptotique (Figure 16) est l'activation de la caspase-3, une cystéine protéase clivant spécifiquement un certain nombre de substrats différents, qui, en combinaison, produisent le phénotype apoptotique. L'apoptose a été appelée à juste titre « la mort par mille coupures » (Martin and Green, 1995). L'activation de la caspase-3 se produit par traitement protéolytique d'un précurseur inactif; l'enzyme activatrice caspase-9 appartient à la même classe de protéases que la caspase-3 et plusieurs autres protéases impliquées dans la signalisation de la mort cellulaire (voir ci-dessous). La caspase-9, à son tour, est activée par la formation d'un complexe multiprotéique appelé « apoptosome ». Le composant central de l'apoptosome est Apaf-1, une ATPase de la classe STAND (Danot et al., 2009), qui est capable de détecter la présence de

Figure 15. Modalités de mort cellulaire en réponse à une infection.

Diagramme représentant certaines des caractéristiques de différents types de mort cellulaire programmée pouvant survenir en réponse à une infection chez les plantes et les mammifères. Mort des cellules suite à la réponse hypersensible chez les plantes (a), à la pyroptose (b) et à la nécroptose (c) dans les cellules de mammifères. (d’après (Coll et al., 2011))

Figure 16. Apoptose, voies extrinsèque et intrinsèque.

L'apoptose extrinsèque est induite par l'addition des ligands sur les récepteurs de mort ou par le retrait des ligands des récepteurs de dépendance. CASP8 et CASP10 initient l'apoptose extrinsèque médiée par le récepteur de mort, tandis que CASP9 initie le retrait de l'apoptose extrinsèque médiée par le ligand du récepteur de dépendance. Pro-CASP8 et pro-CASP10 sont enzymatiquement inactives jusqu'à ce qu'elles interagissent avec FADD (Fas-associated via death domain), qui est activée lors de la liaison aux récepteurs de mort cellulaire répondant à leurs ligands. Les dommages à l'ADN, l'hypoxie, le stress métabolique et d'autres facteurs peuvent induire une apoptose intrinsèque, qui commence avec MOMP et conduit à la libération de protéines mitochondriales (par exemple, CYCS) dans le cytosol. CYCS cytosolique interagit avec APAF1, qui recrute pro-CASP9 pour former l'apoptosome. MOMP est étroitement contrôlée par la famille BCL2, y compris ses membres pro-apoptotiques et anti-apoptotiques. CASP3, CASP6 et CASP7 sont considérées comme les caspases effectrices courantes pour l'apoptose extrinsèque et intrinsèque. En outre, la voie extrinsèque peut déclencher l'apoptose mitochondriale intrinsèque par la génération de BID tronqué (tBID) par CASP8 activée. Le tBID peut se déplacer vers les mitochondries et provoquer la MOMP par l'activation de BAX et BAK1. (d’après (Tang et al., 2019))

cytochrome c libéré par les mitochondries. Lors de la liaison au cytochrome c, Apaf-1 subit un changement conformationnel majeur, conduisant à l'exposition de son domaine d'oligomérisation N-terminal. Ce domaine CARD (Caspase Activation and Recruitment Domain) sera ensuite hétéro-oligomérisé avec un autre domaine CARD trouvé à l'extrémité N-terminale du précurseur inactif de la caspase-9. Dans cet état oligomérique, deux molécules de caspase-9 proximales peuvent se cliver et ainsi s'activer l'une l'autre. Il existe plusieurs voies menant à l'activation de l'apoptosome, soit de manière autonome, soit en réponse à des stimuli externes via des récepteurs de mort (Elmore, 2007). Ces voies en amont utilisent d'autres caspases (caspase-8, caspase-10) et d'autres domaines d'hétéro-oligomérisation, tels que le « domaine de mort » (DD) et le « domaine effecteur de la mort » (DED), qui relient les composants de signalisation apoptotiques et peut conduire à l'activation des caspases par oligomérisation et clivage induits (Hofmann, 2020). L’apoptosome constitue le paradigme le mieux caractérisé d’un signalosome induisant la mort cellulaire programmée.

L'étape clé menant une cellule à la nécroptose est l'oligomérisation et l'activation de la protéine kinase RIPK3 (Receptor-Interacting serine/threonine Protein kinase) (Figure 17). RIPK3 possède un motif amyloïde RHIM central (RIP Homotypic Interaction Motifs), qui est important pour le recrutement de RIPK3 par d'autres protéines contenant un RHIM, en particulier pour la protéine kinase apparentée RIPK1. Récemment, il a été mis en évidence que le complexe RIPK1- RIPK3 (appelé nécrosome) forme des fibres amyloïdes à base de RHIM avec une alternance de brins RIPK1 et RIPK3 (formation d’un hétérocomplexe amyloïde) (Mompeán et al., 2018) (cet aspect sera développé dans la partie 4). Une fois intégré au sein du nécrosome oligomérique, RIPK3 recrute et phosphoryle une protéine appelée MLKL (mixed lineage kinase domain-like). MLKL est une pseudo-kinase inactive avec un domaine N-terminal constitué de quatre hélices  (4HB), requis pour l'exécution de la mort cellulaire. Lors de la phosphorylation de MLKL, la protéine s'oligomérise, s'associe à la membrane cellulaire, provoque un influx ionique et finalement la rupture des cellules (Figure 18). Comment exactement ces événements sont agencés temporellement et interconnectés reste un sujet de débat. L’hypothèse prévalente à ce jour est que les oligomères de MLKL associés à la membrane forment des pores dans la membrane, soit seuls, soit à l'aide d'autres facteurs cellulaires (Petrie et al., 2019). De nombreux aspects de la mort cellulaire nécroptotique peuvent être imités par l'expression ectopique du domaine amino-terminal MLKL isolé, évitant ainsi la nécessité d'une signalisation en amont et d'une activité RIPK3 (Hofmann, 2020). Nous verrons dans la partie 4 que des systèmes de PCD similaires impliquant des motifs amyloïdes et des effecteurs de mort cellulaire présentant des homologies avec MLKL ont été caractérisés chez les champignons filamenteux.

L'événement clé dans l'exécution de la mort cellulaire pyroptotique (Figures 14 et 15) est le clivage protéolytique de la gasdermine D (GSDMD) à une position centrale, qui permet de séparer le

Figure 17. Structure des protéines RIP1 et RIP3 de la nécroptose humaine.

(A) Organisation du domaine des protéines humaines RIP1 et RIP3 (B) Alignement de séquences de RIP1 et RIP3 autour du motif RHIM principal. (d’après (Li et al., 2012))

Figure 18. Représentation schématique des trois cascades de la nécroptose.

VOIE A: la liaison au récepteur du TNF provoque le recrutement de RIPK1 et d’autres protéines associées dans un assemblage appelé « Complexe I ». Dans des circonstances spécifiques, l'ubiquitinase CYLD provoque la dissociation de RIPK1 du complexe I lié à la membrane. RIPK1 se liera à casp8 et à ses protéines associées, formant le « Complexe II ». Dans les situations où la casp8 est inhibée, la protéolyse normale de RIPK3 est limitée. Cette prévention du clivage de RIPK3 augmente la concentration cytosolique de RIPK3, lui permettant d'interagir avec RIPK1 via les interactions RHIM:RHIM, ce qui conduit à la phosphorylation de RIPK3. Le RIPK3 phosphorylé recrute d'autres monomères RIPK3, conduisant à une autophosphorylation et à la formation d'une structure fibrillaire appelée le nécrosome. VOIE B: le récepteur TLR3/4, lorsqu'il est activé par un ligand, recrute la protéine adaptatrice TRIF, qui s'associe à RIPK1 via des interactions RHIM:RHIM. Dans certaines circonstances, RIPK1 et TRIF se dissocient du « Complexe II » pour recruter et phosphoryler plusieurs copies de RIPK3, formant un nécrosome. VOIE C: ZBP1 est activée par l'ADN et l'ARN viral et se lie ensuite à RIPK3 via les interactions RHIM:RHIM. Ce recrutement de RIPK3 entraîne une liaison et une autophosphorylation supplémentaire de RIPK3. Dans les trois cascades, la phosphorylation et l'activation de RIPK3 dans une structure de nécrosome entraînent la phosphorylation ultérieure de MLKL,

domaine N-terminal d’exécution de mort cellulaire de son domaine C-terminal inhibiteur. Plusieurs caspases (non apoptotiques) sont capables de cliver GSDMD, en fonction du déclencheur initial et de la voie de signalisation en amont. Une voie de signalisation répond au lipopolysaccharide intracellulaire (LPS) et clive la GSDMD par la caspase-11 chez la souris et la caspase-4/5 chez l'homme. Une autre voie de signalisation dépend de l'activation de l'inflammasome et utilise une caspase majeure, la caspase-1 pro-inflammatoire. Une fois activées, ces caspases cliveront non seulement la GSDMD mais également d'autres protéines avec des sites de clivage accessibles, surtout la forme de l'interleukine (IL)-1β, formant ainsi la forme mature et active de cette cytokine pro-inflammatoire. On pense que le domaine N-terminal libéré de GSDMD subit un changement conformationnel majeur, conduisant à son oligomérisation et à la formation d'un grand pore membranaire, qui permet la libération d’IL-1β activée. Outre la GSDMD, d'autres membres de la famille des gasdermines ont des domaines N-terminaux clivables qui favorisent la formation des pores (Feng et al., 2018). Récemment, la structure du pore de la gasdermine A3 a été résolue par cryo-microscopie électronique (EM) et s'est avérée former un tonneau β à 108 brins, composé de 27 unités de gasdermine (Ruan et al., 2018). Il a également été rapporté que d'autres protéases provoquent la mort des cellules pyroptotiques dépendant de la gasdermine (Xia et al., 2020). Dans les cellules infectées par le pathogène bactérien

Yersinia pestis, la caspase-8 apoptotique peut être activée par un complexe multiprotéique appelé le

« RIPoptosome », qui à son tour conduit au traitement de la GSDMD et de la GSDME par la caspase activée, entraînant la pyroptose (Orning et al., 2018; Sarhan et al., 2018). Il a été démontré que l'élastase ELANE spécifique des neutrophiles, une sérine-protéase sans rapport avec les caspases, clive la GSDMD à un autre endroit, ce qui entraîne la génération d'un fragment N-terminal cytotoxique (Kambara et al., 2018; Hofmann, 2020). Il est intéressant de noter qu’une protéine « gasdermin-like » appartement a un système d’IV chez N. crassa a récemment été caractérisée et se trouve donc impliquée dans un système de mort cellulaire programmée fongique (Asen Daskalov et al., 2020).

Les cellules qui meurent par nécrose programmée libèrent des contenus intracellulaires, dont plusieurs composants sont interprétés comme des DAMPs par le système immunitaire, entraînant une inflammation (Schaefer, 2014; Roh and Sohn, 2018). L'apoptose, en revanche, est un processus plus compliqué car il doit tuer la cellule de manière fiable tout en empêchant en même temps la fuite de matériel intracellulaire et de DAMPs. Au cours de l'apoptose, la cellule est divisée en un certain nombre de vésicules membranaires plus petites appelées « corps apoptotiques », qui sont ensuite éliminées par des processus phagocytaires (Elmore, 2007; Nagata, 2018). L'apoptose est donc parfaitement adaptée à la mort cellulaire programmée sur le plan du développement, un processus physiologique n’étant pas censé alerter le système immunitaire (Fuchs and Steller, 2011; Hofmann, 2020).

Figure 19. Schéma général d’assemblage d’un inflammasome.

L’activation et l’oligomérisation des PRRs permet de recruter et de nucléer des filaments de la protéine adaptatrice ASC. Le filament ASC induit à son tour la nucléation de filaments de procaspases-1 et -8. (d’après (Vajjhala et al., 2017))

Figure 20. Structures de SMOC formées par le mécanisme de polymérisation nucléée.

(A) Un diagramme en ruban de la structure en cryo-microscopie électronique des filaments polymérisés du domaine ASC pyrine (ASCPYD) dans les inflammasomes (représentés en rouge, violet et orange pour chacun des trois brins hélicoïdaux), en complexe avec des filaments de protéines polymérisées AIM2PYD (absent in melanoma 2 PYD) (illustré en bleu) formés lors d'une stimulation par l'ADN double brin (ADNdb). (B) Un diagramme en ruban de la structure en cryo-microscopie électronique du domaine d'activation et de recrutement de la protéine de signalisation antivirale mitochondriale polymérisée (MAVSCARD) dans la voie du récepteur de type RIG-I (RLR) (illustré en violet), en complexe avec un tétramère de RIG-I2CARD (retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) double CARD) (illustré en bleu, cyan, vert et jaune) lors de la stimulation par l'ARN viral. (C) Mécanisme proposé de polymérisation nucléée pour la formation des SMOC ASCPYD et MAVSCARD. Les récepteurs (par exemple, AIM2 et RIG-I) sont représentés par des quartiers rouges pour les monomères et par des disques rouges pour les