thérapeutiques éventuelles
A. Le serum anti-DGDG active la phagocytose de T gondii par les macrophages via l’opsonisation du parasite
L’opsonisation est le processus par lequel certaines immunoglobulines activent la phagocytose de l’antigène auquel elles sont liées. Ces substances, appelées opsonines, recouvrent l’antigène, ce qui facilite la fixation des cellules phagocytaires qui sont dotées de récepteurs pour ces opsonines.
Toxoplasma gondii est capable d’envahir l’ensemble des cellules nucléées des animaux à sang chaud, y compris les cellules phagocytaires comme les macrophages ou les monocytes. Peu après l’invasion active du parasite dans ce type cellulaire, la vacuole parasitophore empêche la fusion avec les endosomes précoces ou les lysosomes de la cellule hôte (Sibley et al. 1985). Ce processus permet au parasite d’échapper à la dégradation lysosomale et donc de contourner le système immunitaire inné de l’organisme hôte. La phagocytose des parasites libres peut toutefois se produire lorsque celui-ci est opsonisé, par exemple par des IgG : il y a alors reconnaissance du fragment constant (Fc) de l’anticorps par les récepteurs spécifiques du fragment Fcγ des IgG (FcγR) présents en surface de la cellule phagocytaire. Ce phénomène entraîne la phagocytose du parasite puis une fusion des vacuoles lysosomales avec le phagosome. Il y a alors acidification du compartiment, causant la dégradation du parasite par action concertée avec l’ensemble des acteurs lysosomaux (Sibley et al., 1985, Joiner et al., 1990, Mineo et al., 1993).
Une étude menée sur l’opsonisation de T. gondii par des IgG anti-SAG1, montre que ce processus n’empêche pas l’invasion du parasite dans les macrophages (Fadul et al. 1995). En effet, les parasites opsonisés sont capables d’envahir les macrophages puis de se répliquer dans la cellule.
Nous avons engagé une série d’analyses pour évaluer si une opsonisation induite par une incubation avec le serum anti-DGDG pouvait conduire à une augmentation de la phagocytose et à la dégradation de toxoplasmes opsonisés par les macrophages de rat BN. Afin de discriminer les parasites qui auraient envahi les macrophages de ceux phagocytés et en voie de dégradation, nous avons utilisé un système de fluorescence double. Des parasites de la souche RH-YFP (Gubbels et al. 2003), prétraités ou non avec le serum anti-DGDG ou le serum pré-immun, ont été mis à en contact avec des leucocytes (contenant essentiellement des macrophages) issus de péritoines de rats. Les leucocytes ont été préincubés en présence de Lysotracker (Invitrogen) qui permet de visualiser les compartiments acides de types lysosomaux (ou phagosomes fusionnés à des vésicules) par une fluorescence rouge. Après invasion, il est donc possible de distinguer les parasites extracellulaires ou ayant envahi les macrophages grâce à la flurorescence de la YFP seule, des parasites phagocytés et en cours de digestion grâce à une double fluorescence verte/rouge (jaune lors de la fusion des fluorescences). Il est ainsi possible de réaliser des comptages des populations phagocytées.
Un dernier marquage au Hoechst permet la reconnaissance des leucocytes (fluorescence bleue de l’ADN contenu dans les noyaux ; Figure 4, A).
Les parasites ont été pré-incubés en parallèle pendant 30 minutes avec du serum anti- DGDG (dilutions 1/1, 1/5 et 1/10), un anticorps monoclonal anti-SAG1 (Tg 17.054, mêmes concentrations), le serum pré-immun et du milieu PBS non complémenté en parallèle. Nous avons utilisé environ 5000 macrophages et un rapport d’environ 50 parasites par macrophages pour chacune des conditions expérimentales. Les traitements ont été effectués trois fois en duplicata. Le nombre de parasites phagocytés est variable d’une expérience à une autre, le comptage a donc été réalisé sur 20 champs représentatifs (Figure 4, B). Le nombre de parasites phagocytés lors du contrôle sans traitement constitue la référence du test. L’effet sur l’opsonisation des différents traitements est exprimé en pourcentage (positif ou négatif) par rapport au contrôle.
Les résultats (Figure 4) montrent que le serum anti-DGDG entraîne une augmentation du nombre de parasites phagocytés par comparaison avec le lot contrôle. L’effet est plus marqué lorsque le serum est utilisé pur (dilution 1/1), avec une augmentation d’environ 15% à 20%, par rapport au contrôle alors que cette augmentation n’est que de 10% lorsque le serum est utilisé à la dilution 1/5. On n’observe pratiquement plus d’effet à une dilution au 1/10. Le serum pré-immun ne semble pas provoquer d’augmentation du nombre de vacuoles lytiques contenant des parasites. De plus, comme précédemment rapporté (Fadul et al. 1995), l’opsonisation par l’anti-SAG1 n’entraîne pas d’augmentation notable de la phagocytose des parasites. Les résultats obtenus lors de ce test avec l’anticoprs anti-SAG1 corroborent les travaux antérieurs rapportant que l’anti-SAG1 peut être internalisé dans la vacuole parasitophore avec le parasite et ne pas gêner sa division (Fadul et al. 1995). Le serum anti- DGDG semble par comparasion induire la voie phagocytaire.
Figure 4 : Effet de l’opsonisation
des tachyzoïtes, par les Ig présentes dans le serum de lapin anti-DGDG, sur l’augmentation de leur phagocytose par les macrophages de rat BN. (A) Des leucocytes extraits du péritoine de rat BN ont été isolés, comptés, mis à adhérer sur lame (1 h) et préincubés avec du Lysotracker (1/50.000, 1h) dans du milieu de culture. Des toxoplasmes de souche RH-YFP ont été placés au contact des leucocytes pendant 3 h à 37°C. L’ensemble a été fixé et perméabilisé avec du Triton X-100 (0.1%), coloré par la méthode de Hoechst (1/15.000 final en PBS) et monté sur lames. Les parasites extracellulaires ou envahis (flèches blanches) sont visualisés par mesure de la fluorescence dans le vert (594 nm). Les parasites phagocytés et en voie de dégradation (pointes de flèches blanches) sont visualisés par mesure de fluorescence rouge (488 nm) et verte (jaune sur la superposition -merge-). (B) Le graphique représente la variation du pourcentage de parasites phagocytés et en voie de digestion en pourcentage par rapport au contrôle (parasites n’ayant subi aucun prétraitement). Phase RH-YFP Lyso Tracker Hoechst Merge
A
α-DGDG Pre-immune B -5 0 5 10 15 20 anti-D GDG 1/1 anti-D GDG 1/5 anti-D GDG 1/10 anti-S AG1 1 /1 pre-im mune 1/1 p a rasi tes p h ag o cyt és (% /c o n tr o l)B. Le serum de lapin anti-DGDG active la voie classique du