Choix et optimisation d’un test systématique de mesure d’une IC50 de molécules antiparasitaires sur le modèle Toxoplasma gond

Nous avons observé que les inhibiteurs obtenus par criblage sur l’activité MGDG synthase de plante possédent des propriétés anti-parasitaires contre T. gondii sans pour autant définir les conditions dans lesquelles ces molécules agissaient sur le parasite. Le test classique pour mesurer l’IC50 d’une molécule toxique sur une population de parasites consiste à

mesurer l’incorporation spécifique d’uracile radiomarqué ([5,6-3H]uracile) par le parasite,

reflétant sa prolifération (Pfefferkorn et Pfefferkorn 1977). Le coût et les déchets radioactifs que génère cette méthode ont amené le développement de tests alternatifs, colorimétriques (McFadden et al. 1997, Derouin et Chastang 1988) ou encore basés sur la mesure de fluorescence (Gubbels et al. 2003).

- Un des premiers tests colorimétriques mis au point est un test ELISA où la prolifération parasitaire est suivie grâce à des anticorps dirigés contre des parasites préalablement fixés au méthanol (Derouin et Chastang 1988).

- Une seconde méthode colorimétrique repose sur la prolifération de parasites génétiquement modifiés pour exprimer le gène de la β−galactosidase : la croissance de la population de parasites est estimée par colorimétrie en ajoutant du chlorophenol red-β-D-galactopyranoside (CPRG) en tant que substrat de la β−galactosidase (McFadden et al. 1997).

- Une troisième méthode permet l’évaluation de la croissance parasitaire par mesure de la fluorescence de parasites exprimant la protéine YFP (yellow fluorescent protein) en tandem sous le contrôle des promoteurs de la tubuline et de la protéine de surface SAG1 (Gubbels et al. 2003).

La méthode par incorporation d’[5,6-3_{H]uracile a été écartée du fait du grand nombre}

de manipulations prévues, de la quantité de composés radioactifs à gérer et de la multiplicité des étapes nécessaires pour la mesure finale. Il en a été de même du test ELISA qui lui aussi

nécessite de nombreuses étapes de manipulations intermédiaires pour la lecture. Ces étapes ne sont pas compatibles avec notre volonté de développer un test mis en œuvre de façon systém

de gamme étalon pour la seconde. Chaque test a été réalisé en trois séries de puit

onibles au laboratoire n’était que de 103 parasites (± 100 parasites) (résultats non

montré

atoire, car le seuil de détection minimum a été déterm

étrique. La plaque est ensuite placée

atique.

Les deux souches utilisées pour la mise en œuvre du test colorimétrique (souche exprimant la β−galactosidase) ou du test fluorimétrique (souche exprimant la YFP) se cultivent aisément. J’ai donc élaboré des tests de suivi de la prolifération de Toxoplasma gondii suivant ces deux méthodes en parallèle, lors d’expériences préliminaires sur plaques 96 puits, dans un premier temps avec des gammes croissantes de parasites sur le fond des puits

(2,50, 100, 2.102, 5.102, 103… 109). Le même type de test a été mis en œuvre en présence

d’un tapis cellulaire confluent de cellules HFF recouvrant chaque puits, suivant le protocole développé au laboratoire et détaillé dans la partie Matériel et Méthodes. La première expérience sert alors

s tripliqués.

Les résultats ont montré que la méthode fluorimétrique était peu robuste, imprécise lorsqu’il s’agissait de déterminer un faible nombre de parasites et ce malgré, l’utilisation de deux fluorimètres différents. Le seuil de détection de ce test, réalisé avec les appareils de mesure disp

s).

La méthode par mesure de la β−galactosidase est plus précise, tout au moins dans les conditions de détection propres au labor

iné à 50 parasites (± 10 parasites).

Le principe du test est le suivant : après le temps nécessaire pour la culture des parasites (souche RHβGal) en présence de la drogue à tester, le milieu extracellulaire est éliminé, puis un tampon permettant la lyse des cellules humaines et la libération des parasites intracellulaires, est ajouté pendant 30 minutes à 50°C. Le milieu réactionnel de la β−galactosidase est ensuite ajouté, avant l’activation de la β−galactosidase elle-même à 37°C pendant 5 min. Enfin, le substrat chromophore CPRG est ajouté au milieu. La plaque est placée à 37°C pendant un temps variable qui dépend de la quantité d’enzyme présente dans les puits, ce qui permet le développement de la réponse colorim

dans un lecteur optique et la réponse est lue à 570 nm.

Les résultats obtenus par mesure de la β−galactosidase peuvent être évalués de manière directe par une simple observation de la plaque en présence de CPRG. Néanmoins, parce que la lyse de parasites extracellulaire entraîne la libération d’une plus grande quantité d’enzyme active dans le milieu et donc accessible au substrat, une surestimation du nombre de parasites peut se produire : une grande partie du milieu liquide pouvant contenir des parasites extracellulaires, doit donc être éliminée avant lecture. Enfin, la demi-vie de la β−galactosidase étant longue (McFadden et al. 1997), le test mesure une accumulation de l’enzyme dans le milieu plutôt qu’une quantité produite pendant un faible laps de temps. Au vu des avantages et malgré les quelques inconvénients énoncés, le test par mesure de l’activité β−galactosidase a donc été choisi pour mesurer l’IC50 des inhibiteurs de la MGDG synthase

et de leurs dérivés. Cette méthode nécessite l’utilisation d’un milieu de culture sans rouge phénol car celui-ci interfère avec le produit coloré formé par l’hydrolyse du CPRG par la

β−galactosidase lors de la mesure de l’IC50 (Figure 10).

Figure 10 : Exemple de plaques de mesure de la prolifération de Toxoplasma gondii par détection de

la β−galactosidase, permettant la détermination d’IC50 de composés antiparasitaires. Sur la plaque de 96 puits figurée à gauche, les puits les plus jaunes sont ceux où la présence de β−galactosidase est la plus faible. Cette coloration est proche de celle du milieu de culture sans rouge phénol. Les puits dont le milieu présente une coloration plus pourpre (en haut à gauche) sont les puits les plus riches en parasites, possédant une forte teneur en β−galactosidase. Lorsqu’une molécule est antiparasitaire, les faibles concentrations n’induisent pas de toxicité sur le parasite et les puits correspondants sont pourpres ; les concentrations croissantes affectent la prolifération des parasites et les puits corresp

protocoles ont été réalisés n

Cette expé

parasites e is protocoles utilisés ont consisté en :

- deux traitements précédents, à savoir une incubation

des parasites extracellulaires en présence des composés bioactif, suivie d’une ondants présentent une couleur jaune. L’IC50 est au point d’inflexion de la chute de couleur du violet vers le jaune (mesure à 570 nm). Il est alors aisé de différencier une drogue plus efficace avant même la mesure sur lecteur de plaques (photo de droite).

Le mode opératoire de ce test permet de mesurer la concentration en drogue suffisante pour tuer 50 % des parasites (IC50) mais ne permet pas de discerner si les composés ont une efficacité uniquement lors des étapes de vie extracellulaires du parasite ou s’ils possèdent aussi la capacité de traverser les membranes de la cellule hôte et d’être efficaces lors des phases de vie intracellulaire du parasite. Afin d’affiner le mode opératoire et d’apporter un maximum d’information quant à la bioactivité des composés testés, trois

e parallèle avec une concentration fixée à 100 µM pour chacune des molécules. rience a été suivie d’une observation du phénotype et du nombre relatif des nvahis (Figure 11). Les tro

- un pré-traitement des parasites extracellulaires en présence de drogue, suivi d’un lavage afin d’éliminer les composés bioactifs puis d’une invasion des parasites dans les cellules hôtes ;

- un traitement des cellules infectées par remplacement du milieu de culture par le milieu complémenté avec les composés bioactifs ; ce sont alors les parasites intracellulaires qui sont les cibles ;

invasion et enfin, un remplacement du milieu de culture par un milieu complémenté avec les composés bioactifs.

Traitement intracellulaire

Invasion

Mise en culture pendant 24h Traitement Inhibiteur de la MGDG synthase à 100µM (en milieu de culture) Parasites extracellulaires en gamme de dilution Observation Traitement extracellulaire Parasites extracellulaires en gamme de dilution Traitement 1h, 37°C

Lavage (élimination inhibiteur) Invasion

Mise en culture pendant 24h Inhibiteur de la MGDG synthase à 100µM (en PBS) Observation Traitement complet Traitement 1h, 37°C

Lavage (élimination inhibiteur) Invasion

Inhibiteur de la MGDG synthase

à 100µM (en PBS)

Mise en culture pendant 24h Inhibiteur de la MGDG synthase Traitement à 100µM (en milieu de culture) Parasites extracellulaires en gamme de dilution Observation

l’anticorps anti-SAG1 (mAbTG05.54) (images non montrées) et comparées aux parasites n’ayan

modes opératoires sur plaques microtitrées à 96 puits. Les modes opératoires nous permettent de mesurer la quantité de β−galactosidase produite par des nombre fixes de parasites (2, 50, 100, 2.102, 5.102, 103… 109) suivant le même principe que le test précédent (Figure 12).

Figure 11 : Schémas des modes opératoires utilisés pour évaluer l’effet de traitement(s) intracellulaire et extracellulaire de T. gondii par 100 µM des inhibiteurs de la MGDG synthase.

Les observations ont été réalisées en immunofluorescence indirecte par marquage avec t subi aucun traitement (ainsi qu’un contrôle en présence de DMSO). L’un des points les plus marquants de ce test a été l’absence totale de parasite intracellulaire suite au traitement combinant un traitement extracellulaire et intracellulaire.

Traitement extracellulaire

Parasites extracellulaires en gamme de dilution Traitement 1h, 37°C

Lavage (élimination inhibiteur) Invasion

Mise en culture pendant 24h Inhibiteur de la

MGDG synthase à 100µM (en

PBS)

Mesure d’activité βgalactosidase

Traitement intracellulaire

Invasion

Mise en culture pendant 24h Traitement Inhibiteur de la MGDG synthase à 100µM (en milieu de culture) Parasites extracellulaires en gamme de dilution

Traitement complet

Traitement 1h, 37°C

Lavage (élimination inhibiteur) Invasion

Inhibiteur de la MGDG synthase

à 100µM (en PBS)

Mise en culture pendant 24h Traitement Inhibiteur de la MGDG synthase à 100µM (en milieu de culture) Parasites extracellulaires en gamme de dilution

Mesure d’activitéβgalactosidase

Figure 12 : Schéma des modes opératoires permettant le(s) traitement(s) extracellulaire et

intracellulaire pour la mesure de l’activité β−galactosidase produite par un nombre fixe de parasites T.

gondii (souche RHβGal).

Le test extracellulaire (traitement des parasites libres) permet une détection de la

β−galactosidase, dans la limite de détection. Les absorbances mesurés (DO570) sont corrélées

avec la quantité de parasites introduits par puits. Le test intracellulaire montre aussi un effet mesurable suivant la dose de composé, toujours dans la limite de détection. Le test combinant traitement intracellulaire et extracellulaire ne permet pas d’observer l’accumulation de produit coloré (produit par l’activité de la β−galactosidase) après incubation avec les deux drogues. Les conditions pour ce test sont donc saturantes. La mesure d’une IC50 nécessitant un effet dose-mesurable, nous n’avons pas retenu ce dernier mode opératoire pour la détermination systématique d’IC50.

Suite à cette étude préliminaire, nous avons mis au point deux protocoles de mesure de l’IC50, dans les conditions permettant de discerner un effet éventuel sur forme extracellulaire et intracellulaire de Toxoplasma gondi et en corrélation avec les conditions optimales de

détection de la β−galactosidase (Figure 13). La concentration de parasites a été établie à ~104

parasites par puits (de plaque 96 puits).

Lors du traitement intracellulaire, la préparation d’une gamme décroissante de concentration allant de 100 µM à 5 nM en PBS (gamme de concentration préparée par dilutions en cascade) est nécessaire. Des parasites extracellulaires sont purifiés sous leur forme extracellulaire (voir Matériel et Méthodes) et traités pendant 1 h à 37°C sur roue orbitale en présence des différentes concentrations d’inhibiteurs. Les parasites sont lavés puis

déposés sur les tapis de HFF des plaques pendant 12 minutes à 37°C. Les parasites encore extracellulaires après ce laps de temps sont éliminés par trois lavages successifs. L’ensemble parasites envahis / cellules HFF est mis en culture pendant 48h. La mesure de l’IC50 est ensuite réalisée selon le protocole décrit (voir Matériel et Méthodes).

Traitement intracellulaire

Parasites extracellulaire (104_{/condition en PBS)}

(1)Invasion (suivie de lavages pour élimination des parasites extracellulaires)

(2)Inhibiteur de la MGDG synthase Gamme de concentration: de 5nM à 100µM (en milieu de culture sans rouge

phénol)

Mise en culture (48h, milieu+inhibiteur)

Mesure d’IC50

Traitement extracellulaire

Parasites extracellulaire (104_{/condition en PBS)}

Inhibiteur de la MGDG synthase Gamme de concentration: de 5nM

à 100µM (en PBS)

Traitement: 1h à 37°C

Lavages (élimination inhibiteur)

Mise en culture (48h, milieu de culture sans rouge phénol seul)

Invasion

Lavages (élimination des parasites extracellulaire)

Mesure d’IC50

Figure 13 : Schéma des modes opératoires définitifs pour les traitements des formes extracellulaires

et intracellulaires de T. gondii (RHβGal) par les inhibiteurs de la MGDG synthase sur plaque de 96 puits. 104 _{parasites ont été mis en culture sur plaque en présence de cellules HFF. Les parasites ont}

subi un prétraitement avec différentes concentrations des molécules DB-E-PDB ou DB-BE-PDB (traitement extracellulaire) ; ou ils sont incubés en présence d’un milieu de culture mélangé avec différentes concentrations des molécules (traitement intracellulaire). Après 48 h de culture des parasite , la teneur en β−galactosidase est mesurée puis une valeur d’IC50 est déduite.

à mesurer. Les mesure

s

Les conditions de culture sont variables selon la position du puits sur la plaque. En effet, les positions extrêmes en bordure de plaques sont à éviter car plus sensibles à l’assèchement du puits. Chaque condition est donc réalisée en triplicat afin d’éliminer les mesures extrêmes liées à ces différences de culture propres à la position sur la plaque. De plus, un nombre important de contrôles (parasites non traités ou milieu ne contenant pas de drogue) est requis avec une répartition régulière sur l’ensemble de la plaque

s d’IC50 ont été réalisées sur la souche RHβGal de T. gondii (type I).