Anti-DGDG DGDG Maréchal et al. 2002
1/100 à 1/25
Sérum de chèvre anti-IgG (H+L) de lapin-Bodipy
1/500 mAbTG17.179 GRA2 Charif et al.
1990
1/500 Sérum de chèvre anti-IgG (H+L) de souris-Texas Red 1/500 mAbYL 1/2 Tubuline-Tyr (tyrosinée) Lafanechère et al. 1994
1/5000 Sérum de chèvre anti-IgG de souris-Cy3 1/500 mAbLEF Tubuline-Glu (détyrosynée) Lafanechère et al. 1994
1/5000 Sérum de chèvre anti-IgG de souris-Alexa 488
1/500 mAb anti-vinculine vinculine 1/500 Sérum de chèvre anti-IgG
de souris -BODIPY
1/500 mAb TG05.54 SAG1 Rodriguez et
al. 1985 Darcy et al.
1992
1/500 Sérum anti-IgG de souris- Texas Red
1/500
Tableau 1 : Liste des anticorps primaires et secondaires utilisés (les anticorps utilisés pour l’ensemble
des expérimentations du chapitre III sont indiqués dans le texte de l’article).
B. Observations par microscopie électronique à transmission
L’ensemble des expérimentations de microscopie électronique présenté dans le chapitre II de ce mémoire à été réalisé en collaboration avec R. Mondragon (CINVESTAV, Mexico). Les tachyzoïtes prétraités à forte concentration de molécules (100 µM) sont rincés 3
fois au PBS puis remis en suspension ((5-7.107/ml) pour être fixés pendant 1 h à température
ambiante dans du paraformaldéhyde 4%, contenant 0.1% de glutaraldéhyde dans du milieu PBS. Une fois rincés, les parasites ont été déshydratés dans l’éthanol et incorporés dans une résine LR White (London Resin Co.) qui est mise à polymérisée pendant 16 h sous UV à 4°C. Les sections fines sont ensuite montées sur des grilles de nickel recouvertes de formvar (Sengupta et al. 98).
C. Etude de la motilité de Toxoplasma gondii (gliding)
Des lames en verre sont recouvertes de poly-D lysine (10µg/mL final enPBS) pendant
1 h à 37°C puis rincée une fois en PBS. Des tachyzoïtes fraîchement lysés (107) sont prétraités
en absence ou présence de molécules bioactives éventuelles (protocole identique au traitement extracellulaire décrit plus haut), puis sont déposés sur lame et laissés à sédimenter pendant 10 min à température ambiante. Le liquide restant après sédimentation est éliminé avec du papier absorbant sans qu’il ne touche la lame. 500 µL de poly-D lysine (10µg/mL dans du milieu D10) sont ajoutés et la lame est mise en incubation pendant 25 min à 37°C. Les traces de déplacement (gliding) sont visualisées par le protocole d’IFI classique avec un anticorps anti- SAG1 en prenant les précautions nécessaires pour ne pas décoller les parasites de la surface de la lame.
D. Etude de la sécrétion du contenu des granules denses et des micronèmes (Protocole de préparation des ESA -excretory secretory antigens-)
Des parasites fraîchement lysés sont filtrés et rincés par du milieu PBS puis comptés
(109). Ils sont ensuite mis en suspension en PBS contenant ou non des inhibiteurs de la
MGDG synthase (DB-E-PDB et DB-BE-PDB) à IC50 et traités pendant 1h à 37°C sur roue orbitale. Les parasites sont ensuite rincés en PBS par trois fois et remis en suspension en PBS, pH 7,4 contenant 0,1% (v/v) de FBS (sérum de veau fœtal). Le milieu est ensuite complémenté par de l’éthanol (1% final (v/v)) et mis à 37°C pendant 30 min selon le protocole développé par Carruthers et al. (1999). Les parasites sont ensuite séparés du contenu des micronèmes par élimination du culot cellulaire après centrifugation à 2000 g. Le surnageant contenant les ESA est collecté et étudié par SDS-PAGE et western blotting.
Succinctement, les ESA et le culot de parasites sont chauffés à 90°C dans un tampon de SDS PAGE contenant 2% de β-mercaptoéthanol, séparés sur gels 10% polyacrylamide (Laemmli 1970) et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les membranes sont étudiées grâce à des anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines MIC2 1/5000 (mAb T3.4A11.2b4, ) et GRA1 1/5000 (mAb Tg 17.43.1, Charif et al. 1990) suivis d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à la phosphatase alcaline 1/10000 (H&L, Promega, France développé par Interchim, France).
V. Méthodes d’étude de l’activité immunologique portée par un
sérum
Ce paragraphe décrit quelques méthodes préliminaires d’analyse de sérums polyclonaux potentiellement dirigés contre des structures et/ou des processus essentiels de Toxoplasma gondii.
A. Immunoagglutination de parasites vivants
Suite à la lyse d’un tapis cellulaire de HFF infecté, les parasites extracellulaires sont collectés et filtrés sur membrane nucléopore (Millipore, diamètre de pore 3 µm), centrifugés à
1000 g à 23°C, lavés en PBS et comptés. Les parasites (2.107 par condition) sont incubés
vivants en présence de sérum anti-DGDG (1/1, 1/2, 1/5 et 1/10) dilué en PBS, ou du sérum pré-immun (mêmes dilutions, dans du milieu PBS), préalablement dé-complémenté pendant 30 min à 52°C, ou en PBS seul. Les différents milieux contenant les parasites sont déposés au fond de puits d’une plaque 24 puits et placés à 37°C. Des observations au microscope optique inversé (Zeiss) toutes les 2 min pendant 1h30, permettent de détecter les phénomènes d’immunoagglutination.
B. Immunoagglutination de parasites fixés
Le test d’immunoagglutination de parasites fixés est réalisé à l’aide du kit « Toxo- Screen DA » de BioMérieux. (ref 75 481), à partir des instructions du fournisseur. Ce test est détaillé dans le chapitre II.
C. Mesure de la phagocytose induite par l’opsonisation des parasites par les sérums
Des macrophages sont prélevés dans le péritoine de rats BN. Ces macrophages sont rincés et comptés sur cellule de Thoma. Pour chaque condition, 5000 macrophages sont déposés sur des lamelles, sur lesquelles ils adhèrent, au fond de puits de plaques multipuits, pendant 1 h à 37°C. Cette incubation s’effectue dans du milieu D10 contenant du Lysotracker (Molecular Probe, Invitrogen) à une concentration finale de 1/50.000 permettant de colorer les compartiments lysosomaux. En parallèle, des parasites extracellulaires fraîchement lysés, de souche RH-YFP (Gubbels et al. 2003 ; 50 parasites/macrophage dans chaque condition) sont filtrés sur membrane nucléopore (diamètre de pore 3 µm), centrifugés à 1000 g à 23°C, lavés
en PBS et comptés. Les parasites (2.107 par condition) sont incubés vivants dans du sérum
anti-DGDG (1/1, 1/2, 1/5 et 1/10) dilué dans du milieu PBS, ou dans le sérum pré-immun (mêmes dilutions, en PBS), un anticorps monoclonal anti-SAG1 (mAb Tg05.54) ou dans le PBS seul pendant 30 min, à 37°C, sur roue orbitale. Les parasites sont lavés par deux fois dans du PBS, mis en suspension dans du milieu D10 puis mis au contact avec les macrophages pendant au moins 3 h à 37°C dans le milieu D10-Lysotracker. Après cette incubation, les lamelles sont fixées, colorés avec du Hoechst selon le protocole de l’IFI (voir plus haut) puis montées sur lames en présence de Mowiol. Les parasites phagocytés et en voie de digestion sont repérés par leur double fluorescence.
D. Mesure de l’activation de la voie classique du complément induite par l’opsonisation de T. gondii par les différents sérums
Suite à la lyse d’un tapis cellulaire de HFF infecté, les parasites extracellulaires sont collectés et filtrés sur membrane nucléopore (Millipore, diamètre de pore 3 µm), centrifugés à
1000 g à 23°C, lavés en PBS et comptés. Les parasites (2.107 par condition) sont incubés
vivants dans du sérum anti-DGDG (1/1, 1/2, 1/5 et 1/10) dilué dans du PBS, ou du sérum pré- immun (mêmes dilutions, dans du PBS) et dans du PBS seul pendant 30 min, à 37°C, sur roue orbitale. Les parasites sont lavés par deux fois dans du PBS, puis remis en suspension dans du PBS. 20 µL issus de chacune des conditions sont mélangés dans du sérum humain (NHS) séronégatif pour la toxoplasmose (Etablissement Français du Sang, Grenoble) contenant le complexe protéique C1q et l’ensemble des facteurs nécessaires à l’activation de la voie classique du complément. L’ensemble parasites-sérum-NHS est incubé pendant 1 h à 37°C afin d’activer le complément. L’activité du complément subsistant dans le sérum est ensuite mesurée selon le protocole de TH50 (time of 50 % of hemolysis) (Abbal et al. 1991). Brièvement pour le test de TH50, des érythrocytes de mouton (Ellitech) sont sensibilisés avec un anticorps anti-érythrocyte (Hémolysine, BioMérieux) au 1/4000 pendant 15 min à 37°C
pour former une particule sensibilisée (antigène-anticorps). L’ensemble parasites-sérum-NHS
(20 µL) est mélangé avec 3 mL de solution d’érythrocytes sensibilisés (4.106/mL) dilués dans
du milieu DGVB++ (2,5% glucose, 0.05% gélatine, 2.5mM veronal, 72,5 mM NaCl, 0.15
mM Ca2+, 0.5% Mg2+). La lyse est détectée par mesure de l’absorbance de l’hémoglobine à
660 nm en fonction du temps sur un spectromètre (Safas 190DES). Le point d’inflexion définit le temps nécessaire pour obtenir la lyse de 50% de la quantité d’hématies de départ. L’activation du complément par le sérum d’intérêt diminue la lyse érythrocytaire puisque les protéines du complément nécessaires à la reconnaissance des hématies sensibilisées ont été consommées lors de l’incubation initiale des parasites avec le sérum et le NHS. Le TH50 de référence est défini dans les conditions où il n’y a ni parasite, ni sérum (ici PBS+NHS). L’activité du complément restante après cette incubation initiale est exprimée par le ratio (TH50 contrôle/TH50 échantillon) x 100.