Etudes préliminaires de l’effet des molécules DB-E-PDB et DB BE-PDB à forte concentration (100 µM) sur le développement de

Toxoplasma gondii

Afin de déterminer si les inhibiteurs de la MGDG synthase végétale possédent un effet sur le phénotype et/ou le développement de T. gondii, une analyse préliminaire a été engagée en traitant des parasites pendant 1 h avec les composés DB-E-PDB et DB-BE-PDB puis en les mettant au contact de fibroblastes humains. L’effet des molécules a été observé 12 h plus tard en microscopie optique à contraste de phase (Figure 7).

Figure 7 : Invasion et division intracellulaire de Toxoplasma gondii en présence de DE-E-PDB et de

DE-BE-PDB. Des toxoplasmes prétraités pendant 1 h avec chacun des composés, ont été mis en présence de cellules HFF, à confluence (voir Matériel et Méthodes). Après 12 h de culture à 37°C, les cellules infectées ont été observées en contraste de phase au grossissement x100. (A) Contrôle PBS. Les parasites sont prétraités en présence de milieu PBS. (B) Contrôle DMSO. Les parasites sont prétraités en présence de 0,1% DMSO en solution dans du milieu PBS. (C) Parasites traités par le DE-E-PDB. (D) Parasites traités par le DE-BE-PDB. Les parasites sont prétraités en présence des molécules DE-E-PDB et DE-BE-PDB, inhibitrices des MGDG synthases de plantes. Les deux molécules sont solubilisées dans du DMSO, 0,1% dans du PBS. Très peu de parasites intracellulaires sont observables. Aucune rosette n’est détectée. (E) Parasites traités par l’haloxyfop. Les parasites sont prétraités en présence d’haloxyfop (300 µM), inhibiteur de l’acétyl-CoA-caroxylase de l’acide gras synthase plastidiale de plantes. Cet herbicide est solubilisé par du DMSO, 0,1% dans du milieu PBS. Barre d’échelle : 1 µm.

La Figure 7 présente des champs représentatifs de l’ensemble des tapis cellulaires. Les parasites témoins préincubés pendant 1 h dans du PBS se sont développés normalement en formant de multiples rosettes contenant 8, 16, voire 32 parasites par vacuole. Le prétraitement des parasites par la drogue DE-E-PDB (100 µM en solution de PBS, 0,1% DMSO) est délétère pour le toxoplasme : très peu de parasites intracellulaires sont détectés et les quelques vacuoles observées ne contiennent pas plus d’un parasite (Figure 7C). Un effet similaire de la drogue DB-BE-PDB, bien que moins prononcé, est aussi observé (Figure 7D).

A titre de contrôles, nous avons vérifié que le traitement des parasites par 0,1% DMSO n’était pas préjudiciable à l’invasion et au développement intracellulaire (Figure 7B) et que l’herbicide haloxyfop (300 µM) décrit comme antiparasitaire après plusieurs cycles d’invasion/multiplication (Zuther et al., 1999 ; Jelenska et al., 2002), n’affectait pas le développement de T. gondii au cours d’une invasion primaire (Figure 7E). Ces résultats montrent que les inhibiteurs de la MGDG synthase ont des effets drastiques sur le développement de T. gondii in vitro.

Nous avons par ailleurs effectué des comptages du nombre de vacuoles observées ainsi que du nombre de parasites par vacuoles, quand celles-ci étaient présentes, après traitements des parasites par les drogues utilisées à 100 µM, en comparaison avec des parasites non traités. D’après ces numérations préliminaires, le composé le plus efficace (DB-E-PDB) aurait tendance à réduire le nombre de vacuoles de 80 à 90% par rapport au contrôle et le second (DB-BE-PDB) engendre une réduction de 60 à 70%, avec un nombre de parasites n’excédant jamais deux par vacuole. Les parasites traités en contrôle avec du DMSO, dans des concentrations similaires, ne montrent aucune altération du nombre de vacuoles et de parasites par vacuoles. Le prétraitement de parasites par les drogues utilisées à 100 µM semble donc affecter la capacité d’invasion du parasite et peut-être même sa faculté de division par des mécanismes encore inconnus.

Les effets observés sur le développement de T. gondii par un traitement avec le composé DB-E-PDB nous ont amené à penser que la drogue aurait pu induire des changements majeurs dans la structure de parasite. En collaboration avec R. Mondragon (CINEVSTAV, Mexico), nous avons donc observé les parasites incubés en présence des inhibiteurs de MGDG synthase, en microscopie électronique à transmission.

La Figure 8 montre que l’ultrastructure du parasite est altérée. L’ensemble des parasites traités montre une désorganisation de la structure de leur pellicule (Figure 8B-C-D). La membrane plasmique semble se désolidariser du complexe membranaire interne (noté dans ce mémoire IMC ; Figure 8D). Sur de nombreux parasites, l’IMC forme des structures flottantes en ruban (Figure 8B) et la cellule montre des vacuoles internes. Sur certains des clichés, on peut même voir que la membrane plasmique forme des évaginations massives remplies du contenu du cytosol (Figure 8C et encart blanc). L’IMC par contre, conserve sa forme initiale.

Bu IMC Va Contrôle A B C IMC PM PM PM D

Figure 8 : Les tachyzoïtes de T. gondii extracellulaires prétraités par 100 µM de DB-E-PDB montrent

une désorganisation de la pellicule. Par rapport au contrôle (A), les parasites prétraités (B et C) par 100 µM de l’inhibiteur DB-E-PDB de la MGDG synthase pendant 1 h montrent une perte de la forme en croissant caractéristique de la cellule parasitaire. On observe une désolidarisation de la membrane plasmique (PM) de l’IMC (D). Celle-ci forme alors des structures en forme de rubans (flèche en B) et des vacuoles (Va) à l’intérieur du parasite. Le contenu du cytosol se vidange à l’intérieur de ces structures étirant la membrane plasmique (C), qui forme alors des évaginations massives (Bu). Ce phénomène n’altère pas l’intégrité de l’IMC (B et encart blanc) mais engendre une rupture de la membrane plasmique (encart blanc), rupture vraisemblablement liée à la mort du parasite. Clichés en

microscopie électronique à transmission réalisés par R. Mondragon (CINEVSTAV, Mexico).

raitement est distinct des processus morphologiques observés en cas d’apoptose ou de nécrose.

te

Le phénomène d’évagination de la membrane plasmique, qui se désolidarise de l’IMC, a également été décrit lorsque le parasite est traité par le glycérol (Rabjeau et al. 1997) et par la toxine α de Clostridium scepticum (Wichrowski et al. 2002). Il est difficile de déduire de ces observations si le phénotype observé est la conséquence directe du traitement ou bien celle de la mort du parasite. Il est néanmoins possible de conclure que le phénotype observé après le t

B. Etudes de l’effet des molécules DE-E-PDB et DE-BE-PDB à for