Séparation du kb ladder

Ayant fixé la géométrie, le fluide porteur, l’influence des deux paramètres que sont la chute de pression le long du canal principal∆P et la différence de tension ∆V reste à mener. Pour ce faire, des chro- matogrammes ont été construits pour trois chutes de pression (200, 300, 700 mbar) correspondant à des vitesses de maximale de fluide au centre de la canalisation variant de 100 à 300µm.s−1et des différences de tension variant de 0 à 40 V, correspondant à des amplitudes de champ électrique de 0 à 14,8 V.cm−1. Les chromatogrammes obtenus sur une puce unique sont présentés sous forme de tableau dans la figure 4.7.

À la lumière de ces mesures, nous pouvons d’emblée conclure sur l’impossibilité de séparer les es- pèces moléculaires par simple application d’un champ hydrodynamique tel que décrit par Liu et al. [Liu et al., 2011]. Considérant les conditions expérimentales décrites dans leur publication et la loi de Poiseuille reliant la vitesse maximale du fluide dans un capillaire de longueur L et de rayon R :

v0= 2vmoy=

R2∆P

4µL (4.1)

Nous obtenons une vitesse moyenne de fluide de l’ordre de 120µm.−1s pour R = 1µm, ∆P ∼ 7bar , L =

75 cm et une viscosité égale à celle de l’eau à température ambiante. Cette valeur est comparable aux vitesses de fluide dans nos expériences. Nous confirmons ainsi, que sans autre mode d’actionnement que l’entraînement de fluide, des longueurs de migration de l’ordre du mètre sont nécessaires. Compte tenu de la longueur de migration millimétrique possible sur nos systèmes, ces expériences confirment la nécessité de l’emploi d’un mode d’actionnement alternatif. Les chromatogrammes obtenus par addition d’un champ électrique contraire démontre la possibilité de séparer les différentes espèces moléculaires en solution. L’apparition de pics d’intensité témoigne des arrivées séquentielles des espèces suivant le seul critère les différenciant à savoir leur taille.

Avant de mener plus loin nos conclusions il semble nécessaire ici de mettre plus en avant la procédure d’assignation des bandes. Les échelles moléculaires commerciales sont ainsi faites qu’elle permettent d’assigner à chaque bande son poids moléculaire correspondant (pourvu que le processus de sépa- ration soit monotone avec les tailles moléculaires). Comme décrit dans la figure 4.5, le kb ladder est composé d’une espèce moléculaire (3000 bp) comptant pour une masse ∼ 3 fois supérieure aux autres. Autour de cette bande centrale sont présentes quatre espèces de tailles inférieures, et 5 espèces de tailles supérieures. Cette composition particulière donne un premier critère pour l’assignation des bandes par la simple observation des intensité relatives relevées sur les chromatogrammes. Le chromatogramme

FIGURE4.7 – Chromatogrammes obtenus pour la séparation du kb ladder pour des chutes de pression∆P = 200 à 700 mbar et des différences de tension∆V = 0 à 40 V. La longueur de migration étant égale à 4.8 mm pour une longueur totale du canal principal de 7 mm. La barre d’échelle, sauf clairement mentionné représente 30 s. Ces expériences ont été menées à la suite les unes des autres sur un dispositif unique.

FIGURE4.8 – Chromatogramme obtenu pour la séparation du kb ladder pour∆P = 500 mbar et ∆V = 30 V . À chaque pic d’intensité est associée l’image de fluorescence obtenue au même instant.

représenté dans la figure 4.8 correspond aux conditions∆P = 500 mbar et ∆V = 30 V . Sur celui-ci apparaissent 10 maxima d’intensité relatives. Un pic central notable est observé pour t ∼ 3,5mi n. Quatre pics sont observés pour des temps inférieurs et cinq pour des temps supérieurs. Le critère des masses relatives présentes dans l’échantillon nous permet d’avancer que les plus petits brins arrivent antérieurement aux espèces de longueur supérieures. Cette observation est confirmée à l’aide des images de fluorescence sur lesquelles on observe une diminution de la densité des objets avec le temps, diminution cohérente avec l’augmentation de la taille des molécules. Un autre critère pouvant être mis en avant correspond à l’intensité émise par molécule individuelle. Le nombre de fluorophores intercalés étant proportionnel à la taille des molécules, il en résulte une augmentation de l’intensité rayonnée par chacune d’entre elles. Constat encore possible à la vue des images de fluorescence asso- ciées à chaque pic du chromatogramme.

À la lumière de ces éléments, nous pouvons ainsi affirmer que notre méthode de séparation ne corres- pond pas à une méthode de chromatographie hydrodynamique associée à un effet d’exclusion stérique aux parois. En effet, dans le cas d’une chromatographie hydrodynamique, les objets de diamètre hydro- dynamique supérieur sont élués antérieurement à ceux de diamètre plus faible. Notre système permet une élution plus rapide des espèces de bas poids moléculaire, comme dans une séparation classique par électrophorèse sur gel.

Les chromatogrammes de la figure 4.7 permettent de dessiner les tendances globales de la séparation. Sans champ électrique aucune séparation n’est observée. Pour des vitesses de fluide et des champs électriques modérés les bandes de plus hauts poids moléculaires sont bien résolues. Cette observation est manifeste sur le chromatogramme obtenu pour∆P = 200 mbar et ∆V = 20 V présentant 8 pics discernables. On repère le pic d’intensité supérieure, correspondant à la bande des brins de 3000 bp, pour t∼ 3.5 min. À droite de celui-ci les cinq bandes de poids supérieurs (4, 5, 6, 8, 10 kbp) sont résolues. Pour détecter toutes les bandes du kb ladder, un bon compromis pour les deux paramètres∆P et ∆V semble avoir été trouvé pour∆P = 500 mbar et ∆V = 30 V où sont visibles les 10 bandes correspondant aux 10 espèces contenues dans l’échantillon. La résolution des bandes de poids moléculaires inférieurs

FIGURE4.9 – Chromatogrammes obtenus pour la séparation du 100 bp ladder pour des chutes de pression∆P = 1 à 3 bar et des différence de tension∆V = 20 à 150 V. La longueur de migration étant égale à 5.3 mm pour une longueur totale du canal principal de 8 mm. La barre d’échelle représente 30 s.

requiert des vitesses de fluide et des amplitudes de champ électrique plus importantes. Les cinq bandes de poids moléculaire le plus bas sont clairement résolues pour∆P = 700 mbar et ∆V = 40 V . Le pic d’intensité supérieure correspondant à la bande de 3000 bp.

Les observations précédentes nous permettent de dessiner une stratégie pour la résolution des espèces de poids moléculaires inférieurs. La partie qui suit a pour sujet la séparation du ladder 100bp.