4.3 Résultats de la séparation
4.3.3 Analyse des performances : vitesse de migration et nombre de plateau théoriques
terme de vitesse moyenne en fonction du poids des espèces1. Les figures 4.12 et 4.13 présentent ces valeurs pour respectivement le kb ladder et le 100 bp ladder. Les calculs de dispersion sur la vitesse des molécules v =Lmi g
τ ont été menés considérant l’additivité des erreurs relatives sur le positionnement
du détecteur et sur le temps d’arrivée : ∆ ¯v ¯ v = ∆Lmi g Lmi g + ∆τ τ (4.2)
en prenant∆Lmi g= 80 µm (champ de la caméra) et ∆τ égal à la largeur à mi hauteur des pics d’intensité
observés.
Les vitesses moyennes mises en avant par ces graphiques suivent des lois de puissance en N−1.33 pour le kb ladder et N−2.75pour le 100 bp ladder. Ces exposants dépassant les N−1correspondant à l’électrophorèse sur gel comme dépeint en introduction. Un exposant supérieur se traduit par une meilleure résolution des espèces. En effet, prenons par exemple le cas des bandes de 500 et 1000 paires de bases. La loi en N−1de la chromatographie sur gel prévoit une variation de la vitesse de migration
d’un facteur 2. Pour une loi en N−2on s’attend à une vitesse quatre fois plus rapide, ce qui explique en partie la possibilité de séparer ces deux espèces en des temps courts, sur une faible longueur de migration comme dans notre cas.
Dans le domaine de la chromatographie, deux grandeurs font référence afin de quantifier l’efficacité d’une méthode de séparation. La résolution R et le nombre de plateaux théoriques Np.
1) Pour deux espèces 1 et 2 arrivant suivant des gaussiennes d’écart-typesσ1,2et centrées en des temps
1En électrophorèse, il est d’usage de mesurer la mobilité des molécules, définie comme la vitesse divisée par l’amplitude
du champ électrique. Cette définition nous est ici interdite, car la superpostion des actionnement ne se fait pas de manière linéaire, comme nous le démontrerons plus loin.
FIGURE4.10 – Chromatogrammes obtenus pour la séparation du 100 bp ladder pour∆P = 3 bar et ∆V = 0 à 150
V. La longueur de migration étant égale à 5.3 mm pour une longueur totale du canal principal de 8 mm. La barre d’échelle, sauf clairement mentionné, représente 30 s.
FIGURE4.11 – Chromatogramme obtenu pour la séparation du ladder 100 bp pour∆P = 3 bar et ∆V = 100 V . À chaque pic d’intensité est associée l’image de fluorescence obtenue au même instant.
FIGURE4.13 – Variation de la vitesse en fonction de la longueur des molécules contenues dans le 100 bp ladder pour∆P = 3 bar.
t1,2, la nomenclature IUPAC [ETTRE, 1993] définit la résolution comme :
R1,2= | t2− t1|
2 (σ1+ σ2)
(4.3) Deux espèces peuvent être considérées comme clairement séparées pour R > 1.5, séparées de manière incomplète pour R ∼ 1 et mal séparées pour R ∼ 0.75 Cette expression est relative, aussi la donnée des chromatogrammes suffit souvent à exprimer si deux espèces sont correctement séparées ou non. Ainsi, pour le cas de la séparation kb ladder sous une différence de pression de 500 mbar et 30 V de chute de tension (figure 4.8), cette valeur est de 3.6 entre les bandes de 2000 et 3000 paires de bases mais tombe à 0.85 pour les bandes 500 et 1000 paires de bases.
2) La notion de nombre de plateaux théoriques est héritée de la séparation sur colonne à distiller. Cette notion consiste à considérer que le mouvement des espèces se fait par sauts successifs le long de la colonne, la longueur de ce saut définissant un plateau. Pour les deux espèces 1 et 2 précédentes, Npse
définit comme [ETTRE, 1993] :
Np= 5.545
t1,2
4σ1,2
(4.4) où 5.545 est pris comme approximation de la valeur 8 ln 2. Afin de rendre comparables les méthodes, on trouve dans la bibliographie la référence au nombre de plateaux théoriques par mètre de séparation
N m =LNmi gp . Cette valeur est présentée dans la figure 4.14 pour les différentes espèces résolues dans
notre expérience .
Comme le montre ce graphique, Nm est compris entre 104et 106dans nos expériences pour des tailles de molécules comprises entre 600 et 10000 paires de bases. Ces valeurs sont tout à fait compatibles avec l’état de l’art des technologies de séparation sur puce [Kaji et al., 2010], supérieures à ce que l’on peut obtenir sur gel d’électrophorèse. De bien plus grandes valeurs de ce nombre de plateaux théoriques
FIGURE4.14 – Nombre de plateaux théoriques par mètre (Nm) en fonction de la longueur des molécules pour différentes conditions expérimentales.
existent dans la littérature pour l’électrophorèse capillaire(N m ∼ 1 − 5.107) mais celles-ci sont souvent annoncées pour des petites molécules.
La donnée du nombre de plateaux théoriques par mètre peut apparaître comme discutable notamment dans le domaine de la séparation sur puce : les faibles dimensions sur lesquelles ont lieu les migrations ont pour effet de gonfler hypothétiquement les valeurs de N m. Dans le cas des matériaux élaborés par structuration à l’échelle micro-nanométrique, la fabrication de telles matrices à l’échelle macro- scopique s’apparente à une vision chimérique. La technique que nous avons mis au point, même si cela reste à mettre en œuvre, est dans ce domaine, bien moins impactée. Des capillaires de quelques microns de rayon sont des produits distribués dans le commerce, de même que les sources de tension et de pression adaptées pour des longueurs de migration plus importantes.
4.3.4 Conclusions sur les expériences de séparation
Ainsi avons nous démontré la possibilité de séparer des molécules d’ADN par taille grâce à un actionne- ment hybride, combinaison de champs électrophorétique et hydrodynamique. Ce mode de séparation possède des avantages majeurs au rang desquels nous pouvons citer l’absence de matrice solide, un temps et une longueur de migration très faibles, une consommation faible d’échantillon. L’absence de gel solide a pour avantage premier de rendre la puce microfluidique réutilisable. On notera ici que les différents chromatogrammes présentés dans la figure 4.7 ont été obtenus sur une durée inférieure à 3h d’expérience, le tout sur une unique puce.
Le temps de séparation apparaît comme un critère important dans les expériences de tri de molécules : un temps court permet l’intensification des procédés mais surtout de limiter l’élargissement des pics par diffusion. Pour la séparation d’un kb ladder par électrophorèse sur gel, environ vingt minutes de migration sont nécessaires. Et ce temps ne comprend pas le temps de fabrication du gel, et son impact sur la reproductibilité de la séparation. Nos expériences ont démontré qu’une durée inférieure à dix minutes est nécessaire pour séparer la même gamme de taille, et de l’ordre de 3 minutes pour la séparation de molécules de taille inférieure.
l’état, la trop faible quantité de matériel séparé interdit la réutilisation des espèces post-séparation. Un basculement pour une migration sur capillaire, augmentant les débits, permettrait de répondre à cette attente. En terme d’efficacité, les différents paramètres ajustables (hauteur du canal, chute de pression, différence de tension) font de cette méthode une méthode versatile : une étude plus en profondeur permettra d’élargir le spectre des molécules séparables.
Ainsi l’amélioration des performances peut passer par deux routes parallèles. La première consiste à multiplier les expérimentations de manière à cerner les paramètres essentiels à la séparation. La deuxième consiste à simplifier le problème et tenter de mettre en évidence les mécanismes physiques permettant ces performances. Dans le cadre de cette thèse, c’est cette dernière route que nous avons décidé de suivre. Les différentes expériences que nous avons pu mener dans ce but seront décrites dans la partie qui suit.