Rôles biologiques

Bien que les deux isoformes de sphingosine kinase présentent une forte homologie et qu’ils aient tous deux pour rôle de phosphoryler la sphingosine, ces deux isoenzymes divergent par de nombreux aspects. En effet, ces deux isoenzymes diffèrent par leur poids moléculaire, leur expression dans les différents tissus et leur localisation subcellulaire ainsi que par leurs propriétés enzymatiques. Il n’est donc pas surprenant que ces deux enzymes aient des fonctions régulatrices totalement divergentes. Toutes deux pourraient même réguler de manière totalement différente le taux de S1P qui joue un rôle prédominant dans la survie et la prolifération cellulaire. Cependant, la SphK2 semble, comme la SphK1, jouer un rôle dans certains processus transmis par la S1P, comme la dégranulation des mastocytes lors de réactions allergiques et la migration de cellules cancéreuses mammaires. Les sphingosine kinases ont également été impliquées dans la prolifération et la survie cellulaire, la régulation de l’homéostasie calcique, le développement et la régulation des systèmes nerveux et vasculaires, l’inflammation, l’immunité et la croissance tumorale (Hait et al., 2006 ; Taha et al., 2006 a).

a- L’inflammation

Comme décrit précédemment, la SphK1 joue un rôle dans l’adressage des cellules immunitaires et inflammatoires depuis les organes lymphoïdes vers la circulation sanguine et lymphoïde (Pappu et al., 2007).

Un rôle pro-inflammatoire de la SphK1 au niveau de l’endothélium a également été démontré en situation d’hyperglycémie : des hauts niveaux de glucose stimulent en effet cette enzyme au niveau de l’aorte et du cœur chez le rat, induisant ainsi l’expression de molécules

59 d’adhésion pro-inflammatoires permettant l’adhésion de leucocytes aux cellules endothéliales (Wang et al., 2005 a).

Toutefois, les souris simplement invalidées pour le gène de la SphK1 présentent une réponse inflammatoire (chronique ou aigüe) tout à fait normale. En effet, en cas de péritonite expérimentale chez ces souris, le recrutement et la fonction des cellules inflammatoires ne sont pas perturbés ; de même, les phénomènes inflammatoires au niveau des articulations chez ces animaux atteints d’arthrite rhumatoïde sont normaux. Ces résultats suggèrent que la SphK1 intervient mais n’est pas indispensable dans les processus inflammatoires (Michaud et al., 2006).

b- Régulation de l’homéostasie calcique

Le rôle de la SphK1 dans la mobilisation du calcium (Ca2+) sous l’effet d’agonistes a été largement démontré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques ou de siRNA spécifiques (Heringdorf et al., 2004). En effet, l’inhibition spécifique de la SphK1 prévient l’augmentation rapide de la concentration calcique intracellulaire requise notamment pour la dégranulation des mastocytes lors de réactions allergiques (Melendez et al., 2002).

L’implication de la sphingosine kinase 2 dans la régulation de l’homéostasie calcique a également été récemment montrée dans des cellules NIH3T3, une surexpression de cette enzyme augmentant le taux basal de Ca2+ (Maceyka et al., 2005).

c- Prolifération et survie cellulaires

Les sphingosine kinases jouent un rôle important dans la prolifération et la survie cellulaire ainsi que la croissance tumorale.

La SphK1, quand elle est surexprimée dans des fibroblastes murins NIH3T3, favorise la transition G1/S, stimulant ainsi la prolifération de ces cellules, et peut inhiber leur réponse apoptotique face à différents stress cellulaires, favorisant ainsi la survie de ces cellules (Olivera et al., 1999). Cette surexpression favorise également l’expansion clonale en milieu agar de ces cellules et leur confère la capacité de former des tumeurs en xénogreffe sous- cutanée chez la souris Nude (Xia et al., 2000). Ces observations ont permis de considérer la SphK1 comme un véritable oncogène. Toujours dans ce modèle cellulaire, l’activité de la SphK1 augmente l’activation de l’oncogène Ras, transformant ainsi ces cellules saines en cellules malignes. Les cellules surexprimant la SphK1 échappent d’ailleurs à l’inhibition de contact, propriété caractéristique des cellules transformées (Takuwa et al., 2002).

Dans les cellules cancéreuses mammaires MCF-7, la surexpression de la SphK1 stimule la prolifération dépendante des oestrogènes de ces cellules (effet inhibé par un dominant négatif de la kinase) ainsi que la formation de tumeurs chez la souris (Nava et al., 2002 ; Sukocheva et al., 2003). A l’inverse, une inhibition de la SphK1 dans ces cellules induit l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose, démontrant ainsi que cette enzyme est nécessaire à la survie de ces cellules (Taha et al., 2006 b). Les oestrogènes induisent une élévation biphasique de l’activité de la SphK1 qui serait liée à la transactivation du récepteur à l’EGF via l’activation de la SphK1 et du récepteur de sphingosine 1-phosphate S1P3 (Sukocheva et al., 2006).

Une autre étude a également montré que l’interaction de la SphK1 avec la protéine adaptatrice TRAF2 lors de la stimulation par le TNF-α est nécessaire pour l’activation du facteur de transcription NF-κB qui transmet ainsi son effet anti-apoptotique (Xia et al., 2002).

Par ailleurs, dans les cellules endothéliales, une élévation de l’activité de la SphK1 induit la déphosphorylation et l’activation de la protéine RPK118 qui elle-même active la voie Pi3K/Akt, favorisant ainsi la survie de ces cellules. Ce mécanisme est toutefois à distinguer de l’activation de cette même voie Pi3K/Akt et des MAPK par de la S1P ajoutée de façon exogène (Limaye et al., 2005).

Enfin, une étude récente a montré que la SphK1 contribuait à la régulation de l'accumulation du facteur HIF-1 (Hypoxia-Induced Factor-1) lors de l'hypoxie, suggérant un rôle de la SphK1 dans l'adaptation et la survie de nombreuses cellules cancéreuses (prostatiques, mammaires, rénales, gliales et pulmonaires) au stress hypoxique (Ader et al., 2008).

Ces effets pro-prolifératif et pro-survie de la SphK1 ont été conservés au cours de l’évolution, montrant ainsi l’importance de cette enzyme dans la régulation de la prolifération cellulaire chez de nombreuses espèces. Cette protéine, de par ses effets oncogéniques, a d’ailleurs un rôle très important dans la progression et la résistance de nombreux types de cancers aux agents chimiothérapeutiques, rôle qui sera détaillé dans la partie III « sphingolipides et cancer ».

A l’inverse, la SphK2 a un effet anti-prolifératif. Il a ainsi été montré dans plusieurs types cellulaires (notamment les cellules Cos-7, HeLa et NIH3T3) que la surexpression de cette enzyme induit un arrêt du cycle cellulaire au niveau de la transition G1/S par un mécanisme encore inconnu. Une étude a en effet montré que la localisation nucléaire de la SphK2 cause l’inhibition de la synthèse d’ADN, phénomène non observé quand sont surexprimés la SphK1 ou un mutant de la SphK2 ne possédant plus de séquence de nucléarisation (ou séquence

61 NLS). Par contre, la SphK1 acquiert elle aussi la capacité d’inhiber la synthèse d’ADN quand on lui rajoute la séquence NLS de la SphK2. Cependant, l’effet inhibiteur de la SphK2 sur la synthèse de l’ADN n’est pas dû à l’inactivation de son activité catalytique dans le noyau puisque cette enzyme (aussi bien que la SphK1-NLS) purifiée à partir de fractions nucléaires est aussi active que celle isolée dans la fraction cytosolique (Igarashi et al., 2003).

Des travaux ont cependant souligné une différence dans le mode d’action des deux isoformes de SphK2. En effet, si la SphK2-Short inhibe la synthèse d’ADN en absence ou en présence de sérum, la SphK2-Long inhibe la prolifération cellulaire seulement en conditions pauvres en nutriments, suggérant une fonction biologique différente entre les deux isoformes. Cependant, l’induction de la SphK2-L et sa translocation dans le noyau induisent l’arrêt de prolifération des cellules et leur apoptose tout comme la SphK2-Short. Il est possible que le trafic nucléo-cytoplasmique de ces deux isoformes soit régulé de manière différente (Okada et al., 2005).

De plus, la SphK2 possède des propriétés pro-apoptotiques grâce à la présence d’un domaine BH3 dans sa séquence protéique. En effet, les SphK2 murines et humaines, mais non les SphK1, possèdent une séquence de neuf acides aminés correspondant au domaine BH3 (Bcl-2 Homology 3) des « BH3-only proteins », un sous-groupe pro-apoptotique des protéines membres de la famille de Bcl-2 (Liu et al., 2003). Les « BH3-only proteins » interviennent en amont de la voie de transduction apoptotique en activant directement ou indirectement Bak et Bax, induisant ainsi leur oligomérisation et par suite la perméabilisation de la membrane mitochondriale et le déclenchement de la cascade apoptotique. Cette séquence BH3 permet également à ces protéines d’interagir avec (et ainsi d’inhiber) les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 afin de mener la cellule à l’apoptose (Huang et al., 2000). Comme les autres membres de la famille des « BH3-only proteins », la SphK2 interagit directement avec la protéine anti-apoptotique Bcl-xL, causant ainsi son inactivation et induisant l’apoptose dans divers types cellulaires et sous l’effet de nombreux stimuli (stress oxydatif, molécules cytotoxiques, déprivation en facteurs de croissance) en augmentant le relargage du cytochrome c hors de la mitochondrie et l’activation de la caspase 3, enzyme effectrice de l’apoptose. Cependant, étant donné que le fragment N-terminal de la SphK2 qui contient ce domaine BH3 induit l’apoptose de manière moins importante que la protéine entière, il est possible que la sphingosine kinase 2 ait également un pouvoir d’induction de l’apoptose indépendamment de ce domaine BH3. De plus, la mutation d’un résidu conservé de ce motif n’empêche que partiellement l’action pro-apoptotique de la SphK2, confirmant que cette

protéine peut procéder de différentes manières pour induire l’apoptose. Cette même équipe a enfin montré que l’effet apoptotique de la SphK2 est indépendant de la sécrétion de la S1P puisqu’un bloquage des S1PR par la toxine pertussique n’inhibe en rien cet effet, effet également retrouvé dans des modèles génétiquement invalidés pour les récepteurs S1P1-3 (Liu et al., 2003).

Une autre voie de signalisation apoptotique envisageable est la translocation au réticulum endoplasmique de la SphK2, en partie dépendante de son domaine BH3 ; de sa localisation aux membranes du réticulum endoplasmique dépendrait l’action pro-apoptotique de la SphK2. Cet effet pro-apoptotique est par ailleurs perdu par un mutant de la SphK2 catalytiquement inactif, démontrant également l’importance de l’activité de phosphorylation de la sphingosine de la SphK2 pour son effet apoptotique. Cette théorie est appuyée par le fait que l’adressage forcé de la SphK1 au réticulum endoplasmique lui confère de manière surprenante des aptitudes pro-apoptotiques. (Maceyka et al. 2005). Cette équipe a par ailleurs montré que la surexpression de la SphK2 dans les fibroblastes NIH3T3 augmente la réponse de ces cellules à l’agent cytotoxique doxorubicine (Liu et al., 2003). A l’inverse, l’inhibition de la SphK2 par siRNA protège les cellules HEK293 de l’apoptose induite par la déprivation en facteurs de croissance ou le TNF-α (Okada et al., 2005).

Une étude a par ailleurs démontré le rôle opposé des deux sphingosine kinases dans des cellules mésenchymateuses rénales isolées de souris sauvages, invalidées pour la SphK1 ou pour la SphK2. Ces cellules montrent en effet des réponses différentes envers les stimuli apoptotiques. Les cellules isolées de souris sauvages sont sensibles à la staurosporine, qui induit une fragmentation de l’ADN et une activation de la caspase 3 dans ces cellules. Ce phénomène est encore plus marqué dans les cellules de souris déficientes en SphK1. A l’inverse, les cellules issues de souris SphK2-/- ont montré une résistance accrue à cet agent cytotoxique. De plus, la phosphorylation basale et l’activité de la kinase de survie PKB/Akt et de son substrat Bad sont réduites dans les cellules SphK1-/- mais non dans les cellules SphK2-/-. Sous l’effet de la staurosporine, la phosphorylation de PKB et de Bad diminue dans les cellules sauvages et SphK1-/- mais reste élevée dans les cellules SphK2-/-. De plus, la protéine anti-apoptotique Bcl-xL est significativement augmentée dans les cellules SphK2-/-, ce qui doit également contribuer au phénomène de résistance de ces cellules. En résumé, la SphK1 et la SphK2 ont des effets opposés sur la réponse apoptotique des cellules mésenchymateuses rénales induite par un agent chimiothérapeutique. Cela s’explique dans ce

63 modèle par une régulation différente de la voie de signalisation PKB/Bad et de l’expression de Bcl-xL (Hofmann LP et al., 2008).

A partir de ces différentes observations est née l’hypothèse suivante : le lieu de génération du S1P à l’intérieur de la cellule peut réguler différenciellement la prolifération et la mort cellulaire ; le postulat d’une balance entre les taux de S1P cytosolique et membranaire/nucléaire a ainsi été suggéré.

d- Migration cellulaire

Comme déjà cité, la SphK1 est impliquée dans la migration des cellules immunitaires ainsi que dans la formation de fibres de stress favorisant la cytokinésie et la motilité cellulaire. Mais il a également été montré que cette kinase jouait un rôle dans la migration des cellules endothéliales. En effet, en situation d’hypoxie, le facteur HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor 1) induit l’augmentation d’expression de la SphK1, celle-ci possédant dans sa séquence deux boîtes dites HRE (Hypoxia Responsive Element). Cette augmentation de la SphK1 résulte en un phénomène migratoire accéléré des cellules endothéliales, possiblement dans le but de former de nouveaux vaisseaux (Schwalm et al., 2008).

La SphK2, tout comme la SphK1, est phosphorylée par la kinase de survie ERK1 sous l’effet de l’EGF ou du phorbol ester. Cette phosphorylation augmente l’activité des kinases et induit la migration des cellules MDA-MB-453 en réponse à l’EGF (Hait et al., 2007).

e- Régulation du tonus vasculaire

Les sphingosine kinases sont impliquées dans le contrôle du tonus vasculaire. En effet, la surexpression de la SphK1 entraîne une augmentation du tonus et de la résistance artérielle (alors qu’une diminution d’expression de cette enzyme induit l’effet inverse). De la même façon, la S1P ajoutée de manière exogène mime cet effet vasoconstricteur. Par ailleurs, une pression artérielle élevée induit la translocation de la SphK1 du cytosol à la membrane plasmique, indiquant que le phénomène d’ « inside-out signaling » est impliqué dans ce phénomène, la S1P ainsi produite à la membrane agissant par l’intermédiaire de ses récepteurs (Bolz et al, 2003 ; Keller et al., 2006).

A l’inverse, la SphK1 peut également induire la vasodilatation des vaisseaux lorsque celle-ci est médiée par des RCPG. En effet, la réponse contractile en réponse à l’angiotensine II (AgII) est augmentée par la DMS, un inhibiteur de sphingosine kinase. De plus, l’induction de la production de monoxyde d’azote (NO), un agent vasoconstricteur, par l’AgII est inhibée

par la DMS ainsi que par des antagonistes des récepteurs S1P1 et S1P3, suggérant là aussi l’implication de la sphingosine kinase et de l’ « inside-out signaling » (Mulders et al., 2006).

f- Métabolisme de la sphingosine et de la sphingosine 1-phosphate

Il a été montré que bien que générant toutes deux de la S1P (la SphK2 de façon moins importante que la SphK1), les deux isoformes de sphingosine kinases influencent différemment le métabolisme des sphingolipides. En effet, la SphK2 augmente le taux de céramide intracellulaire alors que la SphK1 le diminue.

La SphK2 pourrait avoir un rôle dans la voie de « sauvetage » (d’économie) de la sphingosine dans les cellules de mammifères, agissant de concert avec la S1P phosphatase afin de reconvertir la S1P en sphingosine puis en céramide (Maceyka et al., 2005). Il a d’ailleurs été montré qu’une phosphohydrolase particulière, la S1P phosphohydrolase localisée au niveau du réticulum endoplasmique, voit son activité augmenter lorsque la SphK2 est surexprimée, ce qui augmente le taux de céramide et induit l’apoptose (Le Stunff et al., 2007).

A l’inverse, la S1P cytosolique formée par la SphK1 inhibe la biosynthèse de céramide, servant ainsi probablement de mécanisme senseur régulant les taux de céramide. La SphK1 peut réduire le niveau de céramide en orientant la sphingosine vers sa phosphorylation (puis sa dégradation irréversible par la S1P lyase) plutôt que vers sa reconversion en céramide via la céramide synthase. Il est également envisageable que la S1P formée par la SphK1 régule négativement la synthèse de céramide. En effet, il a été décrit que les bases sphingoïdes à longue chaîne phosphorylées (telles que la S1P) pourraient inhiber l’activité de la sérine palmitoyltransférase et donc la synthèse de novo du céramide. De manière intéressante, les auteurs ont observé que la surexpression de la SphK1 augmente le taux de dihydrosphingosine et donc de dihydroS1P, ce qui a également pour conséquence de réduire les taux de céramide. Cela pourrait s’expliquer par le fait que la S1P cytosolique générée par la SphK1 pourrait réguler négativement la (dihydro)céramide synthase. L’ensemble de ces données suggèrent que la S1P cytosolique produite par la SphK1 a une fonction différente de la S1P générée au niveau du réticulum endoplasmique et/ou d’autres membranes et organelles par la SphK2 (Maceyka et al., 2005) (cf figure 8).

g- Parallèle avec les levures

Les homologues de la SphK1 et de la SphK2 ont également été clonés chez la levure (respectivement Lcb4 et Lcb5) (Nagiec et al., 1998). Comme chez l’Homme, ils semblent

Figure 7- Modélisation intégrée des effets opposés des deux isoformes de sphingosine kinase sur le métabolisme sphingolipidique et la prolifération et la survie cellulaires. D’après Maceyka et al., 2005. La SphK2 agit de concert avec la S1P phosphatase afin de recycler la S1P en sphingosine puis en céramide. Le ceramide généré au niveau du réticulum endoplasmique augmente alors le relargage cytosolique de calcium, induisant l’apoptose. A l’inverse, la S1P généré par la SphK1 inhibe la synthèse de novo de céramide

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également avoir des rôles différents. En effet, la délétion de Lcb4, mais non de Lcb5, prévient l’inhibition de croissance et la mort cellulaire (Kim et al., 2000). A l’inverse, Lcb5, mais non Lcb4, joue un rôle dans la résistance au stress thermique (Ferguson-Yankey et al., 2002). De plus, Lcb4 et Lcb5 ne diffèrent pas seulement dans leurs propriétés d’adressage à la membrane plasmique mais auraient également des localisations subcellulaires différentes. En effet, Lcb4, mais non Lcb5, est présente au niveau du réticulum endoplasmique et il a été suggéré que selon qu’elle est cytosolique ou associée aux membranes, Lcb4 jouerait des rôles distincts et génèrerait différenciellement soit des pools « structuraux » soit des pools de signalisation de bases sphingoïdes à longue chaîne phosphorylées (Funato et al., 2003).