Régulation de l’activité des sphingosine kinases

L’activité sphingosine kinase est stimulée par de nombreux facteurs tels que la liaison de certains ligands sur leurs récepteurs couplés aux protéines G (ligands des récepteurs muscariniques, acide lysophosphatidique, S1P, bradykinine et nucléotides) ou leurs récepteurs tyrosine kinase (PDGF, EGF, NGF, VEGF), le « cross-linking » des récepteurs aux immunoglobulines, le TNF-α, le TGF-β, les interleukines, les agents régulant l’homéostasie calcique et le phorbol ester (Taha et al., 2006 a).

Alors que la plupart de ces stimuli cause une augmentation rapide et transitoire de l’activité sphingosine kinase, vraisemblablement par des modifications post-traductionnelles ou par sa relocalisation subcellulaire, certains facteurs (comme les oestrogènes et l’EGF dans les cellules cancéreuses mammaires, la vitamine D3 dans les kératinocytes ou l’histamine dans les cellules endothéliales) induisent une activation biphasique des sphingosine kinases avec une première augmentation très rapide de leur activité suivie d’une augmentation prolongée de leur transcription (Sukocheva et al., 2003 ; Döll et al., 2005 ; Manggau et al. 2001 ; Huwiler et al., 2006). Les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires par lesquels les différents isoformes de sphingosine kinases sont spécifiquement régulés ne sont pas encore totalement connus. Cependant, il semblerait que la SphK1 soit plus spécifiquement régulée par des interactions protéine/protéine, des phosphorylations, le taux intracellulaire de Ca2+ et sa localisation subcellulaire.

a- Mécanismes de régulation spécifiques de la SphK1

• Régulation par sa phosphorylation : divers stimuli dont le TNF-α (via sa liaison à la protéine adaptatrice TRAF2 pour TNF-Receptor-Associated Factor-2) ou les esters de phorbol stimulent la phosphorylation de la SphK1 sur sa sérine-225 par la kinase ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) via la PKC. Cette phosphorylation est requise pour la stimulation de son activité et sa translocation à la membrane plasmique (Xia et al., 2002 ; Jonhson et al., 2002 ; Pitson et al., 2003). En contrepartie, l’activité de la SphK1 est elle-même requise pour l’activation de ERK1/2 induite par le TNF-α (Pitson et al., 2000 b).

De façon intéressante, la phosphorylation « in vitro » de la SphK1 augmente fortement son activité mais le niveau basal de production de S1P intracellulaire par un mutant non- phosphorylable de la SphK1 (SphK1-S225A) n’est pas beaucoup diminué comparé à celui de l’enzyme sauvage. De plus, alors que la surexpression de la SphK1 dans les cellules NIH3T3 augmente fortement leur prolifération, l’expression dans ces mêmes cellules du mutant SphK1-S225A stimule leur croissance seulement s’il est adressé artificiellement à la membrane plasmique (Pitson et al., 2005). Ce serait donc la production localisée de S1P à la membrane plasmique plutôt que l’augmentation globale d’activité de la SphK1 qui serait responsable de l’effet oncogénique de cette dernière.

La SphK1 une fois relocalisée à la membrane plasmique est responsable du relargage de S1P dans le milieu extracellulaire, induisant ainsi l’activation de récepteurs spécifiques à sept domaines transmembranaires appelés S1PRs (S1P Receptors). Les effets cellulaires sont alors de type cellulaire-specifiques car dépendant du type de S1PR exprimé par la cellule, chacun ayant ses voies de signalisation propres (cela fera d’ailleurs l’objet d’une chapitre à part entière) (Spiegel et al., 2003).

• Régulation par les phospholipides : l’activité de la SphK1 est également stimulée par les phospholipides acides, en particulier la phosphatidylsérine à laquelle elle se lie sélectivement par l’intermédiaire de sa thréonine-54 et de son asparagine-89, acides aminés essentiels pour sa translocation à la membrane plasmique et la sécrétion de S1P. Un modèle a alors été suggéré dans lequel la phosphorylation de la sérine-225 entraînerait l’exposition de ces acides aminés et/ou d’autres résidus liant la phosphatidylsérine, facilitant ainsi leur association à la membrane et augmentant alors l’activité de la SphK1 en la rapprochant ainsi de son substrat, la sphingosine (Stalehin et al., 2005).

La SphK1 est également activée par la Phospholipase D (PLD) dans les mastocytes. En effet, la SphK1 co-localise avec la PLD dans les compartiments endosomaux et peut être

55 transloquée du cytosol vers les membranes cellulaires sous l’addition de PLD en présence de calcium (Ca2+) (Melendez et al., 2002).

• Régulation par le calcium : La chélation du Ca2+

intracellulaire inhibe la formation de S1P alors qu’au contraire des stimuli augmentant la concentration calcique favorisent la production de S1P dans plusieurs modèles cellulaires (cellules leucémiques et cellules H- HEK-293) (Alemany et al., 2000). L’activité de la sphingosine kinase est cependant requise dans ces cellules pour la mobilisation du calcium depuis les stocks intracellulaires (Heringdorf et al., 1998). La SphK1 agirait donc comme un senseur du taux de Ca2+ intracellulaire et pourrait l’augmenter le cas échéant, cette enzyme possédant dans sa séquence un site de liaison à la Ca2+/Calmoduline (résidus 191 à 206) (Kohama et al., 1998). Cependant, une activation directe de la SphK1 par le Ca2+ n’a jamais encore été démontrée. Il a de plus été suggéré que la Ca2+ /Calmoduline en se liant à la SphK1 ne stimule pas son activité mais sa translocation à la membrane plasmique (Young et al., 2003). En effet, sans site de liaison à la calmoduline fonctionnel, la SphK1 n’est pas transloquée à la membrane sous l’effet de la stimulation par le phorbol ester, mais son activité catalytique et sa phosphorylation demeurent intactes (Sutherland et al., 2006).

• Interactions protéine/protéine : de nombreuses protéines ont été décrites comme interagissant avec la SphK1. La protéine AKAP-1 (Protein Kinase A Anchoring protein related, aussi appelée SphK-interacting protein) par exemple interagit avec la SphK1 et inhibe son activation, atténuant ainsi ses effets biologiques (Lacana et al., 2002). La protéine RPK118 (ou PECAM « platelet endothelial cell adhesion molecule ») se lie elle à la SphK1

via son second domaine pseudokinase (PSK2) et régule ainsi la localisation cellulaire de la

SphK1 en l’adressant aux endosomes précoces (Hayashi et al., 2002). L’aminoacylase-1 interagit également avec la SphK1 et induit une inhibition de son activité catalytique in vitro (Maceyka et al., 2004). Enfin, il a été montré dans des fibroblastes embryonnaires murins que la phosphatase Shp-2, sous l’effet d’une stimulation par l’HGF (Hepatocyte Growth Factor), s’associerait avec la SphK1 et favoriserait ainsi la migration cellulaire (Duan et al., 2006). Enfin, la SphK1 interagit également avec la protéine d’échafaudage filamine A au niveau des lamellipodes, cette interaction jouant un rôle dans la migration cellulaire (Maceyka et al., 2008).

• Régulation par protéolyse : une régulation négative de la SphK1 par le TNF-α a récemment été décrite, via le relargage de la cathepsine B dans le cytosol qui clive alors la kinase à de nombreux endroits, diminuant ainsi l’expression de cette enzyme au cours de l’apoptose (Taha et al., 2005).

b- Mécanismes de régulation spécifiques de la SphK2

Par rapport à la SphK1, la SphK2 a été très peu étudiée et peu d’éléments sont à ce jour connus sur cette isoenzyme. La SphK2, tout comme la SphK1, possède de nombreux sites de modifications post-traductionnelles, notamment des sites de phosphorylation par la PKC (sérine/thréonine), un possible site de phosphorylation sur tyrosine, des sites de phosphorylation par la caséine kinase II ainsi que des sites de N-glycosylation et de N- myristoylation (Taha et al., 2006 a).

Il est également montré que la SphK2 peut elle aussi être régulée par des facteurs agonistes. Par exemple, l’Epidermal Growth Factor (EGF) induit l’activation de cette enzyme dans les cellules HEK-293 et les cellules cancéreuses mammaires MDA-MB-453 via sa phosphorylation par la kinase ERK1 (Hait et al., 2007). La SphK2 interagit aussi avec la sous- unité cytosolique du récepteur à l’IL-12 (IL-12Rβ1), induisant ainsi la production d’Interféron γ (Yoshimoto et al., 2003). Enfin, il a été récemment montré que dans les mastocytes, le récepteur à l’immunoglobuline E, FcεRI, interagit avec et active non seulement la SphK1 mais aussi la SphK2 ; la tyrosine kinase Fyn est par ailleurs requise pour l’activation de ces deux enzymes (avec lesquelles elle interagit directement) sous l’effet du FcεRI et pour l’activité basale de la SphK2 (Olivera et al., 2006).

c- Régulation par la localisation subcellulaire

La SphK1 a une activité basale assez importante et sa stimulation par des agonistes n’augmente cette activité que de 1,5 à 2 fois. Il a alors été suggéré que la signalisation de cette kinase est régulée par sa localisation subcellulaire plutôt que par son niveau d’activation. Dans les conditions basales, la SphK1 est une enzyme cytosolique qui est transloquée à la membrane sous l’effet de divers stimuli (notamment des facteurs de croissance) via sa phosphorylation par la PKC ou par ERK1/2 comme exposé précédemment. Cependant, cette enzyme peut également être péri-nucléaire ou endosomale sous l’induction de la PLD 1 (Delon et al., 2004). Aucune séquence NLS fonctionnelle n’a pour l’instant été identifiée dans la séquence protéique de la SphK1. Cependant, cette enzyme comporte deux séquences NES qui peuvent être actives dans des conditions basales. La mutation de ces séquences provoque

57 d’ailleurs l’accumulation nucléaire de cet isoforme, montrant ainsi que la SphK1 pourrait être occasionnellement transloquée dans le noyau (Inagaki et al., 2003). Il est d’ailleurs à noter qu’une étude isolée sur des fibroblastes NIH3T3 a montré une translocation au noyau de la SphK1 active sous l’effet de la stimulation par le PDGF, renforçant ainsi l’effet mitogène de ce facteur de croissance (Kleuser et al., 2001).

La SphK2, contrairement à la SphK1, possède un signal de localisation nucléaire (ou NLS pour Nuclear Localisation Signal) à son extrémité N-terminale (séquence RRGARR). Les mécanismes moléculaires de la translocation nucléaire de la SphK2 ne sont pas encore bien connus. En effet, la localisation nucléaire de la SphK2 peut dépendre du type cellulaire et/ou des conditions de culture cellulaire. Ainsi, il a été montré que dans les cellules cancéreuses HeLa, la SphK2 est majoritairement nucléaire alors que dans les cellules HEK-293 elle se situe dans le cytosol quelles que soient les conditions de culture ; dans le cas des cellules Cos-7 cependant, la SphK2 est majoritairement cytosolique à faible confluence mais devient fortement nucléaire si la densité cellulaire augmente (Igarashi et al., 2003). De même, la privation de facteurs de croissance induit l’import nucléaire de la SphK2 dans les cellules HEK-293 (Okada et al., 2005). Une séquence d’export nucléaire (NES) a également été identifiée et caractérisée dans la séquence protéique de la SphK2 (localisée entre les acides aminés 416 et 425). Cette séquence NES est faiblement fonctionnelle dans des conditions basales mais sous stimulation par l’ester de phorbol PMA, elle est phosphorylée par la Protéine Kinase D (PKD) sur ses résidus sérine et la SphK2 est ainsi exportée du noyau. Par ailleurs, un mutant de la SphK2 non-phosphorylable sur les résidus sérine 419 et 421 (SphK2 S419A/S421A) perd sa faculté de sortir du noyau et s’accumule dans celui-ci. A l’inverse, un mutant de la kinase mimant cette phosphorylation (SphK2 S419E ou S421E) est exportée du noyau sous l’effet du PMA (Ding et al., 2007). La phosphorylation de ces résidus sérines suite à la stimulation par le PMA survient dans le noyau ; il a d’ailleurs été démontré que la PKD est transloquée dans le noyau sous l’effet du PMA (Rozengurt et al., 2005). Il n’a cependant jamais été montré d’interaction directe entre la SphK2 et la PKD.

Enfin, en contradiction avec l’étude d’Okada (Okada et al., 2005), l’équipe de Sarah Spiegel a montré qu’une déplétion en facteur de croissance des cellules HEK-293 ou des fibroblastes NIH3T3 induit également l’adressage de la SphK2 au niveau du réticulum endoplasmique, adressage qui augmente avec la durée de la déplétion (Maceyka et al., 2005).

d- Signalisation «inside-out » des sphingosine kinases

La SphK1 peut être transloquée dans le milieu extracellulaire. En effet, elle est constitutivement excrétée par les cellules endothéliales vasculaires et les cellules HEK-293 par un processus actif et spécifique d’excrétion indépendant du système réticulum endoplasmique /Golgi (Ancellin et al., 2002).

A l’inverse, la SphK2 demeure exclusivement intracellulaire. Les taux de S1P plasmatique chez des souris invalidées pour la SphK1 sont d’ailleurs deux fois moins élevés que ceux des souris sauvages, indiquant que cette enzyme contribue au gradient de S1P existant entre le plasma et les tissus. Il a ainsi été suggéré que le plasma contient une forme soluble de SphK1 (Venkataraman et al., 2006).