1.3. Fonctions des protéines Spt6, Iws1 et de leur complexe
1.3.3. Rôle de Spt6 et Iws1 dans lélongation de la transcription
Les protéines Spt6 et Iws1 participent également à l!élongation de la transcription. Cette activité a été suggérée par (i) l!observation d!une interaction génétique entre les deux protéines et le facteur d!élongation TFIIS, certaines mutations de Spt6 et Iws1 conduisant à l!apparition de phénotypes thermosensibles lorsqu!elles sont croisées avec une souche dst1 et (ii) l!apparition dans des souches portant des gènes Spt6 et Iws1 mutés d!une sensibilité à la 6-azauracil, un composé chimique qui réduit les quantités de GTP et UTP présents dans la cellule et induit un arrêt de la transcription (Hartzog et al., 1998; Fischbeck et al., 2002; Zhang et al., 2008).
1.3.3.1. Colocalisation et interaction de Spt6 et Iws1 avec lARN polymérase II hyperphosphorylée
La colocalisation de Spt6 avec l!ARN polymérase II hyperphosphorylée a été observée au niveau des chromosomes polytènes chez la drosophile (Kaplan et al., 2000; Andrulis et al., 2000), confirmant l!implication de cette protéine dans la transcription. L!analyse du recrutement de la protéine portant une étiquette fluorescente au niveau des gènes de choc thermique dans les cellules de drosophile a permis d!observer la dynamique de son recrutement (Zobeck et al., 2010). Ces études ont permis de montrer qu!en l!absence de choc thermique, la protéine Spt6 colocalise avec l!ARN polymérase II au niveau des gènes impliqués dans le développement de ces organismes (Figure 21A), la réalisation d!un choc thermique conduisant au recrutement rapide de ces deux protéines au niveau du gène Hsp70.
Ainsi, séquentiellement, la protéine HSF est d!abord recrutée (localisation sur le gène 20 secondes après la réalisation du choc thermique), permettant alors le recrutement de l!ARN polymérase II et du facteur PTEF-b (100 secondes après la réalisation du choc thermique) et finalement le facteur Spt6 et la topoisomérase I, qui sont recrutés 20 secondes après l!ARN polymérase II. Le taux de recrutement identique de Spt6 et de l!ARN polymérase II suggère un recrutement parallèle de ces deux protéines.
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Figure 21 : Colocalisation de Spt6 avec l!ARN polymérase II
(A) LARN polymérase II et Spt6 sont colocalisés au niveau des gènes transcrits et recrutés rapidement après un choc thermique de 20 minutes (adapté de Zobeck et al., 2010). (B) Les profils de
recrutement de Spt6 et Iws1 sont proches du profil de recrutement de lARN polymérase II hyperphosphorylée sur les sérines 2 (ARNPII S2, adapté de Mayer et al., 2010).
Les études d!immunoprécipitation de la chromatine montrent des profils de recrutement de Spt6, Iws1 et de l!ARN polymérase II hyperphosphorylée sur la sérine 2 relativement proches (Figure 21B) (Kim et al., 2004; Mayer et al., 2010; Ivanovska et al., 2011). Le signal des protéines Spt6 et Iws1 apparait 50pb après le site d!initiation de la transcription (TSS, Transcription Start Site) parallèlement à l!ARN polymérase phosphorylée sur les sérines 2, le taux de d!occupation de ces deux protéines au niveau de la région codante étant différent. En effet, alors que Spt6 atteint un plateau, la quantité de Iws1 augmente tout au long de la phase codante, le taux d!occupation des deux protéines baissant rapidement au- delà des sites de terminaison (Mayer, 2010). Il a par contre été démontré chez la levure que la colocalisation de Spt6 avec l!ARN polymérase II se limitait aux gènes fortement transcrits (Ivanovska et al., 2011).
L!interaction directe de Spt6 avec le CTD de l!ARN polymérase II hyperphosphorylée a été démontrée par co-immunoprécipitation de ces deux facteurs (Yoh et al., 2007) cette interaction ayant été suggérée par l!observation de la colocalisation des deux protéines. L!expression dans des cellules mammifères de différentes constructions de Spt6 suivie de leur purification a permis de mettre en évidence l!implication du domaine carboxy-terminal de Spt6 dans la formation de ce complexe. Ce complexe est aboli lorsque l!arginine 1358 de Spt6 de souris est mutée, démontrant ainsi le rôle direct du domaine SH2 situé dans le domaine carboxy-terminal de Spt6 (Yoh et al., 2007). La spécificité de la reconnaissance de la sérine 2 du CTD a été confirmée par (i) l!abolition de l!interaction lorsque l!ARN polymérase II est
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déphosphorylée par la phosphatase Fcp1a, (ii) la formation d!un complexe lorsque les sérines 2 du CTD sont phosphorylées par PTEF-b et (iii) l!absence de complexe lorsque les sérines 5 du CTD sont phosphorylées par le facteur TFIIH (Yoh et al., 2007).
1.3.3.2. Spt6 et Iws1 participent et stimulent la phase délongation de la transcription
Les études réalisées dans les levures et les cellules de souris ont permis de montrer clairement un rôle de Spt6 dans l!élongation de la transcription, le rôle de Iws1 dans ce mécanisme n!étant pour l!instant que très peu défini, notamment dans les cellules mammifères. Spt6 participe ainsi (i) à la transcription induite par les récepteurs aux "strogènes (Baniahmad et al., 1995), (ii) à la transcription des gènes de HIV1 induite par la protéine Tat (Yoh et al., 2007), (iii) à la transactivation réalisée par la protéine pUL19 du cytomégalovirus humain (Winkler et al., 2000), et (iv) à la transcription des gènes des histones (White et al., 2011). Chez la levure, la protéine Iws1 participe à la transcription des gènes exprimés de manière constitutive et à la régulation de la transcription de certains gènes inductibles (gènes PHO5, HIS3 et HIS4) (Fischbeck et al., 2002) et notamment du gène CYC1 par le recrutement du complexe de remodelage de la chromatine Swi/Snf (Zhang et al., 2008). D!autre part, dans les plantes, Iws1 participe à la régulation de la transcription des gènes en réponse à l!activation du récepteur aux brassinostéroïdes, le facteur de transcription BES1 permettant de recruter Iws1 au niveau du corps des gènes induits (Li et al., 2010). Il a par contre été démontré que dans les cellules de souris, la suppression de l!expression de la protéine Iws1 ne modifiait pas le taux d!expression d!un gène lacZ placé sous le contrôle du promoteur HIV1 en présence de l!activateur Tat (Yoh et al., 2007). Il semblerait ainsi que la protéine Iws1 ne soit pas impliquée directement dans les processus d!élongation de la transcription dans les cellules mammifères.
Il a également été démontré in vitro et in vivo que Spt6 stimule la phase d!élongation de la transcription. In vitro, sur un ADN nu, la déplétion de la protéine d!un extrait nucléaire ralentit fortement l!élongation de la transcription, l!étape d!initiation n!étant pas impactée puisque des transcrits courts (100pb) sont formés même en l!absence de Spt6 (Endoh et al., 2004). L!ajout dans le milieu de la protéine permet de retrouver un niveau de transcription plus élevé, cette complémentation n!étant cependant plus réalisée dans le cas où une protéine Spt6 ne contenant pas d!extrémité carboxy-terminale est ajoutée, confirmant l!implication de ce domaine dans ce mécanisme.
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In vivo, il a été montré que la suppression de l!expression de Spt6 par l!introduction de
siRNA réduisait fortement le taux de transcription du gène de choc thermique Hsp70 lorsqu!il est induit (Ardehali et al., 2009). La localisation de l!ARN polymérase II au niveau de ce gène en l!absence de Spt6 par des expériences de ChIP révèle une augmentation de l!occupation de l!ARN polymérase II au niveau du site d!initiation de la transcription et une diminution du taux d!occupation au milieu de la phase codante et en 3! du transcrit, reflétant une diminution du nombre de molécules d!ARN polymérase II entrant en phase d!élongation productive. Cette diminution de la vitesse de synthèse de l!ARN polymérase est également détectée par des expériences de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) qui révèlent une diminution du taux de transcription de moitié dans les cellules n!exprimant pas Spt6 (diminuant à 480pb/minutes, contre 1000pb/min dans les cellules contenant Spt6) (Ardehali et al., 2009).
1.3.3.3. Implication des facteurs épigénétiques dans la régulation transcriptionnelle induite par Spt6 et Iws1
Plusieurs études ont également démontré une implication du complexe Spt6/Iws1 dans le dépôt de marques épigénétiques liées à la régulation de la transcription. Chez la levure et dans des cellules de souris, le complexe est ainsi impliqué dans la triméthylation de la lysine 36 de l!histone H3 par les histone méthyltransférases Set2 (chez la levure) et Setd2 chez les eucaryotes supérieurs, cette marque épigénétique reflétant une transcription active (Youdell et al., 2008; Yoh et al., 2008). Chez la souris, plus particulièrement, la suppression de l!expression de Iws1 par siRNA conduit à une diminution spécifique du taux de H3K36me3 au niveau du promoteur et de la phase codante du gène c-myc, également observée lors de la suppression de l!expression de la protéine Setd2. Une interaction directe entre Iws1 et Setd2 a pu être détectée in vivo, qui implique également l!ARN polymérase II hyperphosphorylée et Spt6.
La mutation de Iws1 et Setd2 conduit également à une augmentation du taux de triméthylation de la lysine 27 de l!histone H3 à l!extrémité 5! du gène PABPC1 (Yoh et al., 2008). Dans les plantes, il a également été démontré que Iws1 participait à la régulation de la transcription du gène codant pour le transporteur NRT2.1 impliqué dans la morphologie cellulaire en réponse aux quantités d!azote présentes dans le milieu. Cette répression est notamment modulée par le dépôt de marques épigénétiques au niveau du gène de ce
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transporteur, le taux de H3K27me3 étant augmenté en présence de grandes quantités d!azote qui conduit à la répression de la transcription de ce gène (Widiez et al., 2011).
Ainsi, les protéines Spt6 et Iws1 participent également au processus d!élongation de la transcription réalisée par l!ARN polymérase II en activant notamment la transcription de plusieurs gènes et en stimulant la transcription réalisée par l!ARN polymérase. Cependant, de la même manière que dans le cas de l!activité de chaperonne d!histone, l!activité de facteur d!élongation de Spt6 semble être restreinte à un certain nombre de gènes, probablement ceux fortement transcrits. La régulation de la transcription des gènes, médiée par Spt6 et Iws1, implique également le dépôt de marques épigénétiques qui vont refléter une transcription active (cas de H3K36me3) ou permettre le recrutement de facteurs de remodelage qui permettront la recondensation de la chromatine (H3K27me3) suggérant un lien avec le rôle de modulateur de la structure de la chromatine de la protéine Spt6. Cependant, les gènes présentant une forte diminution de l!association des nucléosomes dans une souche spt6-1004 ne sont pas forcément ceux dont la transcription est fortement dérégulée dans ces souches (Ivanovska et al., 2011). Ces résultats suggèrent que les activités de régulateur de la transcription et de modulateur de la structure de la chromatine de Spt6 pourraient être en partie distinctes.