NOESY 3D A partir du carbone de la chaîne principale ou des chaînes latérales, tous les hydrogènes reliés et effet NOE.

13

C-NOESY 3D A partir du carbone de la chaîne principale ou des chaînes latérales, tous les hydrogènes reliés et effet NOE.

Tableau 7 : Spectres tridimensionnelles mesurés pour l!attribution tridimensionnelle des spectres RMN

2.4.2.3. Stratégie dassignement

Dans un premier temps, les déplacements chimiques de tous les atomes d!hydrogène, de carbone et d!azote de la protéine sont déterminés. La réalisation de cet assignement est généralement divisée en deux temps : (i) l!assignement séquentiel qui a pour but de trouver les systèmes de spins qui se suivent dans la séquence et (ii) l!assignement des atomes des chaînes latérales qui permet d!associer le résidu à un système de spin. Ces assignements ont été réalisés avec le logiciel Sparky développé par Goddard et Kneller.

127

Figure 39 : Stratégie d!assignement séquentiel

Le spectre 15N-HSQC va permettre de définir la fréquence des atomes dazote et dhydrogène de la chaîne principale. En naviguant dans les spectres 3D, la fréquence (i) des carbones des groupements

carbonyles (ii) des C-alpha et (iii) des C-beta du résidu considéré et du résidu précédent vont être déterminés. La connaissance de la fréquence des carbones du résidu précédent vont alors permettre de trouver la fréquence de lazote et de lhydrogène du résidu précédent, permettant ainsi dévoluer le

long de la chaîne peptidique.

L!attribution séquentielle a pour but de trouver les valeurs de déplacement chimique des atomes de la chaîne principale de la protéine et de relier les atomes de la chaîne principale. Seuls les atomes N, H, C, C-alpha et C-beta de la chaîne principale seront considérés. Le spectre 15N-HSQC permet dans un premier temps d!obtenir les déplacements chimiques des atomes d!hydrogène et d!azote de la chaîne principale. Les spectres HNCA/HNCOCA, HNCACB/CBCACONH et HNCO/HNCACO vont permettre de déterminer les valeurs des déplacements chimiques des atomes C-alpha, C-beta et CO (carbonyle) du résidu propre i et du résidu précédent i-1 (Figure 39). Le spectre HBHACONH

128

permet quant à lui de définir les déplacements chimiques des atomes H-alpha et H-béta du résidu précédent i-1.

La connaissance des valeurs de déplacement chimique des atomes C-alpha, C-beta et CO du résidu suivant va permettre de rechercher dans les spectres HNCOCA, HNCACB et HNCO les systèmes de spin présentant ces valeurs. Les valeurs des déplacements chimiques des atomes H et N de la liaison peptidique du résidu suivant i va ainsi pouvoir être retrouvée.

b) Assignement des chaînes latérales

Une fois les systèmes de spins successifs définis, les spectres COSY et TOCSY sont utilisés pour attribuer ces systèmes à la séquence protéique. Les valeurs de déplacement chimiques des atomes C-alphas et C-beta sont des indications du type d!acide aminé. En effet, les valeurs de déplacement chimiques des atomes des chaînes latérales sont caractéristiques des différents résidus. Ainsi, l!identification des chaînes latérales de plusieurs acides aminés va permettre de replacer la séquence protéique dans la succession des systèmes de spins déterminés lors de l!attribution séquentielle.

2.4.2.4. Calcul de la structure

a) Identification des effets NOE et calcul de la structure

Grâce à l!assignement des déplacements chimiques des atomes, il est ensuite possible d!assigner les signaux NOE dont l!intensité est proportionnelle à la distance entre atomes. Le calcul de la structure est réalisé avec la suite logicielle UNIO (Guerry et Herrmann, 2012). Dans un premier temps, le logiciel va utiliser les spectres NOESY 3D et les valeurs de déplacements chimiques déterminées précédemment afin de définir les effets Overhauser. En effet, les spectres NOESY 3D (15N et 13C) permettent d!observer les corrélations entre un atome d!hydrogène de la chaîne principale ou latérale et les atomes d!hydrogènes reliés soit covalements, soit spatialement par l!effet Overhauser par transfert de la magnétisation à travers un atome d!azote (15N 3D NOESY) ou de carbone (13C 3D NOESY). Ainsi pour un atome d!hydrogène donné, certains pics de corrélation vont correspondre aux atomes d!hydrogènes des chaînes principales et latérales (Hg, H ...) pour lesquels les valeurs de déplacements chimiques sont connus, alors que d!autres pics seront issus de la corrélation entre l!atome d!hydrogène considéré et un atome d!hydrogène spatialement proche. L!intensité du pic de corrélation va être proportionnelle à la distance entre les deux atomes d!hydrogènes et la valeur du déplacement chimique de l!atome en interaction va permettre de

129

définir de quel atome et de quel résidu il s!agit. Le programme va ainsi identifier dans les spectres NOESY les corrélations intra- et inter-résidus et déduire les distances séparant deux atomes spatialement proches.

b) Identification des éléments de structure secondaire

Les déplacements chimiques des atomes de la chaîne principale (C-alpha, C, N et H) et du résidu C-beta sont généralement caractéristiques des éléments de structure secondaire dans lesquels ils sont localisés (hélice, feuillet ou boucle). Ainsi, ces valeurs de déplacement chimique sont comparées aux valeurs de déplacements chimiques déterminées pour des structures résolues par RMN, permettant de déduire des valeurs d!angle phi et psi pour le résidu considéré. Le programme Talos+ (Shen et al., 2009) va utiliser la séquence de la protéine et les valeurs de déplacements chimiques des atomes N, H, C, C-alpha et C-beta afin de définir les éléments de structure secondaire de la protéine. Ces éléments de structure secondaire vont permettre d!introduire des contraintes lors du calcul de la structure.

De plus, les contacts NOE observés vont également donner des informations concernant la structure secondaire de la protéine. En effet, des contacts NOE pourront être observés entre les résidus i et i+3/i+4 qui sont localisés dans une hélice g, la présence de feuillets induisant des contacts NOE entre les résidus face à face dans ces éléments de structure secondaire.

La liste de contrainte de distance et la connaissance des éléments de structure secondaire de la protéine vont ainsi permettre la réalisation de calculs de dynamique moléculaire. Ces calculs sont réalisés avec le programme CYANA qui réalise des dynamiques sur les angles de torsion de la molécule (Güntert, 2004).

2.4.2.5. Temps de relaxation T1/T2  dynamique moléculaire

Le retour d!un spin à son état d!origine après application d!un champ B1 peut être décomposé en deux phénomènes : (i) un phénomène de disparition du plan de l!état excité et (ii) un phénomène de réapparition dans le plan de l!état d!équilibre. A chacun de ces phénomènes, une vitesse de relaxation est associée. Ainsi, T1 (relaxation longitudinale) va correspondre au temps de retour des spins à leur état initial et T2 (relaxation transversale) va correspondre au temps de disparition du spin de l!état excité. Ces temps de relaxation sont fonction de l!environnement du spin considéré.

130

Au cours d!une expérience de relaxation, des spectres 15N-HSQC sont enregistrés après différents temps T1 et T2. L!évolution de l!intensité des pics de corrélation observés en fonction des temps T1 et T2 de relaxation imposés va alors refléter la dynamique de la molécule. Dans ces expériences, seuls les couplages H-N de la chaîne principale sont considérés. Ainsi, si le rapport T1/T2 est élevé (entre 4 et 6), le résidu considéré est localisé dans une zone rigide alors que si ce rapport est faible (entre 1 et 3), le résidu est localisé dans une région flexible.

131

Chapitre 3