Matériel et Méthodes
2.1. Techniques de biologie moléculaire
2.1.1. Génération des vecteurs dexpression bactériens
L!expression de protéines en bactéries permet d!obtenir, à faible coût, de grandes quantités de protéines utilisables pour des études structurales. De plus, l!utilisation d!hôtes bactériens permet de tester facilement la solubilité de constructions différentes des protéines d!intérêt, notamment dans le cas des complexes protéiques. C!est la raison pour laquelle les premiers tests d!expression sont généralement réalisés dans ce système d!expression.
Pour faciliter les clonages initiaux, les gènes d!intérêt sont d!abord clonés dans des vecteurs navettes qui sont des vecteurs à haut nombre de copies. Une fois les gènes amplifiés séquencés ils sont extraits des vecteurs navettes par digestion et insérés dans les vecteurs d!expression.
2.1.1.1. 1ère étape : la PCR et la génération des vecteurs navettes Nos gènes d!intérêt codant pour différentes protéines provenaient de différentes sources. Dans le cas des gènes codants pour des protéines d!Encephalitozoon cuniculi, d!Antonospora locustae et de Saccharomyces cerevisiae, ceux-ci ont été extraits par PCR à
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partir des génomes de ces organismes obtenus auprès de laboratoires les produisant. Les autres gènes ont été achetés auprès de banques.
a) Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La réaction de PCR va permettre d!obtenir de grandes quantités d!un fragment d!ADN contenant le gène d!intérêt. Elle est réalisée par une enzyme polymérase, l!ADN polymérase, qui va catalyser l!ajout de désoxyribonucléotides (dNTP) à l!extrémité 5! d!une amorce par complémentarité à la matrice. Les amorces utilisées vont permettre d!introduire aux extrémités du fragment amplifié : un codon initiateur ATG en 5!, un codon stop en 3! ainsi que des séquences reconnues spécifiquement par des enzymes de restriction aux deux extrémités du fragment. Les réactions ont été réalisées avec l!enzyme Phusion dans le cas où le fragment est amplifié dans le but de l!insérer dans un vecteur. L!utilisation de cette enzyme est justifiée par le faible taux d!erreurs introduites. Les conditions de la réaction de PCR sont présentées en annexe 8.1.1 (page 259).
Le produit de la réaction est ensuite déposé sur un gel d!agarose, les bandes correspondantes au produit de l!amplification sont découpées et les fragments sont extraits du gel à l!aide du kit NucleospinÆ Extract II (Macherey Nagel).
b) Insertion dans le vecteur navette
Différents types de vecteurs navettes ont été utilisés, chacun ayant un mode de clonage différent. Selon la longueur du gène et les sites de restrictions choisis, une technique est privilégiée. Les caractéristiques des principaux vecteurs navettes décrits ci-dessous sont récapitulés dans le Tableau 2.
Le vecteur p207 permet l!insertion de fragments digérés avec les enzymes NdeI en 5! et BamHI ou BglII en 3!. Il porte un gène de résistance à la gentamycine. Ce vecteur est une version modifiée du vecteur pDONOR 207 fourni par Invitrogen : les sites de recombinaison homologues att présents de part et d!autres de la cassette de clonage du vecteur commercial ont été utilisés pour introduire des sites de restriction NdeI et BamHI ou NdeI et BglII. Il en résulte qu!une fois le fragment d!ADN cloné dans ce vecteur, la recombinaison homologue (décrite au paragraphe 2.1.1.2.d) peut être utilisée afin de transférer le fragment dans le vecteur d!expression de destination. Pour l!insertion de fragments d!ADN dans ce vecteur, les produits de la réaction PCR sont digérés avec les enzymes de restriction, purifiés sur les colonnes Nucleospin Extract II afin d!éliminer le tampon de l!enzyme de restriction et une
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réaction de ligation est réalisée avec la T4 DNA ligase (Epicentre). Ce vecteur est utilisé principalement pour les fragments d!ADN courts (jusqu!à 2000 paires de bases) lorsqu!aucun site de digestion par NdeI et BamHI ou BglII n!est présent dans le gène.
Vecteur navette Type de clonage Résistance Application
p207 (dérive de pDONOR 207,
Invitrogen)
Restriction/ligation Gentamycine
- Gènes courts (<2000 pb) ne possédant pas de sites reconnus
par les enzymes de restriction NdeI et BamHI ou BglII, - Sous clonage possible par recombinaison homologue. PCR Blunt (Invitrogen) Ligation d!extrémités franches Kanamycine - Gènes courts (< 2000 pb) contenant des sites reconnus par les enzymes de restriction NdeI et
BamHI ou BglII, - Sous-clonage par restriction /
ligation.
pCR2.1 TOPO TOPO TA cloning Ampicilline
- Gènes longs
- Sous-clonage par restriction / ligation
Tableau 2: Les différents vecteurs navettes employés et leurs principales caractéristiques.
Le vecteur PCR Blunt fourni par Invitrogen permet l!insertion de fragments d!ADN possédant des extrémités franches, comme c!est le cas avec les fragments amplifiés par l!enzyme Phusion. Les fragments amplifiés par PCR sont ligués dans le vecteur après leur purification. Les vecteurs ayant intégré le gène d!intérêt vont être sélectionnés grâce au gène ccdB. En effet, le vecteur Blunt est ouvert dans le gène codant pour cet inhibiteur de la gyrase bactérienne. Ainsi, seulement si un ADN est intégré dans le vecteur au niveau de la séquence codante du gène ccdB, la protéine inhibitrice ne sera pas produite et la bactérie pourra se développer. Ce vecteur porte également un gène codant pour une résistance à la Kanamycine. Ce vecteur est utilisé pour les fragments d!ADN courts (jusqu!à 2000 paires de bases) dans le cas où le clonage en vecteur p207 n!est pas réalisable du fait de la présence de sites de digestion par les enzymes de restriction NdeI, BamHI et BglII, il peut alors servir de matrice pour une réaction de mutagenèse dirigée permettant de supprimer ces sites de restriction.
Le vecteur pCR2.1 TOPO (Invitrogen) permet également l!insertion de fragments non digérés. A la fin de la réaction de PCR, 0,5µL de la polymérase de Thermus aquaticus (Taq) sont ajoutés au produit de la PCR. Cette enzyme va ajouter de manière non spécifique une adénosine aux extrémités 3! des fragments amplifiés, permettant ainsi de produire des extrémités sortantes qui pourront s!hybrider au vecteur. Le vecteur fourni est quant à lui
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linéarisé avec à ses extrémités une séquence sur laquelle lenzyme Topoisomérase I est fixée sur une thymidine sortante. Lors de la réaction de ligation, lextrémité adénosine du fragment PCR va shybrider à la thymidine du vecteur et la Topoisomérase va réaliser la réaction de ligation.
Figure 24 : Principe de la réaction de TOPO TA-cloning
Lenzyme Topoisomérase I est liée par une liaison phosphodiester à lextrémité des vecteurs fournis. Cette enzyme va liguer le vecteur ouvert avec le fragment issu de la PCR auquel des adénosines ont
été ajoutées par traitement à la polymérase Taq (adapté de Invitrogen).
Ce vecteur navette est principalement utilisé pour le clonage des très grands gènes (au- delà de 2000 paires de bases).
Une fois les réactions de ligation réalisées, les produits sont transformés dans des cellules DH5g (description des souches bactériennes en annexe 8.1.4, page 262) qui sont ensuite étalées sur un milieu LB-agar contenant lantibiotique dilué au 1000ème, permettant de
sélectionner les bactéries ayant intégré le vecteur, et laissées une nuit à 37°C. Le lendemain, des colonies sont repiquées et mises en culture dans un milieu liquide contenant lantibiotique dilué au 1000ème. Au bout de 16 heures de culture, les cellules sont collectées par centrifugation et les plasmides sont extraits à laide du kit NucleospinÆ Plasmid (Macherey Nagel) puis séquencés.
Différentes techniques sont employées afin de vérifier la présence de linsert cloné dans le vecteur navette avant le séquençage du vecteur. Tout dabord, une réaction de PCR sur colonies peut être réalisée, qui consiste à réaliser une réaction de PCR sur la culture bactérienne liquide avec des amorces spécifiques au gène, lenzyme Taq de Thermus
thermophilus étant utilisée. Au cours de cette réaction, le premier cycle de dénaturation va
durer 3 minutes afin de casser les parois bactériennes, la totalité de lADN bactérien (génomique et plasmidique) servant alors de matrice. Ainsi, si le gène dintérêt est présent dans le vecteur il va être amplifié et sera détecté sur gel dagarose. De plus, après purification
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du plasmide, les enzymes dont les sites de reconnaissances ont été placés en 5! et 3! du gène peuvent être utilisées afin de digérer le vecteur. Le dépôt sur gel d!agarose permettra alors de vérifier la présence d!un insert de bonne taille.
2.1.1.2. 2ème étape : le sous-clonage en vecteurs dexpression
Une fois le vecteur navette obtenu et vérifié par séquençage, le gène codant pour la protéine d!intérêt peut en être ré-extrait et inséré dans un vecteur d!expression soit par la technique de restriction/ligation, soit par recombinaison homologue. La majorité des vecteurs d!expression que nous avons utilisés vont notamment permettre d!introduire en amont du gène de la protéine (i) un site de fixation de la polymérase T7 qui va transcrire le gène (ce qui n!est pas le cas du vecteur pGexNB, décrit au paragraphe b), (ii) un site de fixation des ribosomes (rbs, « Ribosome Binding Site ») qui vont traduire l!ARN messager produit au cours de la transcription et, en fonction des besoins, (iii) une séquence codant pour une étiquette de purification et d!un site de coupure par une protéase qui permettra la purification par chromatographie d!affinité de la protéine. En aval du gène des codons Stops et un terminateur sont placés qui permettent l!arrêt de la traduction et de la transcription respectivement.
a) Les vecteurs d!expression bactériens de la suite pET-MCN
Les vecteurs utilisés font partie de la suite de vecteurs construits par le Dr. Romier (décrite sur le site web http://lbgs.u-strasbg.fr/sbgp/Private/TechRes/CloningProto/Vectors /Vector/SiteWebCRO/Introduction.html). Cette suite de vecteurs permet de tester différentes étiquettes de purifications placées soit à l!extrémité amino-terminale, soit à l!extrémité carboxy-terminale de la protéine ainsi que des sites de coupure par des protéases différents (Tableau 2). Elle permet également la réalisation de tests de co-expression (décrits au paragraphe 2.2.2, page 87), puisque certains de ces vecteurs permettent l!expression de protéines natives, c!est-à-dire ne portant pas d!étiquette de purification et que chacun de ces vecteurs porte des gènes de résistance à un antibiotique et des origines de réplication différentes.
Les vecteurs de cette suite possèdent (i) des cassettes de clonage identiques facilitant le clonage des gènes d!un vecteur navette vers les vecteurs d!expression et (ii) des sites de restriction spécifiques permettant de concaténer les gènes dans un seul vecteur pour tester des interactions à plusieurs partenaires. La procédure de concaténation est décrite en paragraphe
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2.1.2, page 80 et dans la publication 3. Parmi les vecteurs de cette suite, le vecteur pnEA-tH, qui permet l!expression de protéines portant une étiquette de purification (His)6 suivi d!un site
de coupure par la thrombine, et le vecteur pnCS, qui permet l!expression d!une protéine native sont principalement utilisés. Les cartes de ces vecteurs sont présentées sur la Figure 71, en annexe 8.1.5 page 262. Ces vecteurs sont générés par restriction/ligation, sauf dans le cas du vecteur pnEA-tH, pour lequel un vecteur spécifique possédant des sites de recombinaison
att existe, permettant la réalisation d!une réaction de recombinaison homologue.
Vecteur Dérive du vecteur
Etiquette de purification
Site protéase Résistance Origine de réplication pnEA-tX pET-15b (His)6
GST His-Trx, Trx His-MBP, MBP His-NusA, NusA Strep Thrombine TEV Protéase 3C Ampicilline pBR322 pnCS pCDF Duet Expression de protéines natives - Spectinomycine CDF ori
pnYC pACYC11b Expression de protéines natives
- Chloramphénicol p15A
pnEK pET-28b Expression de protéines natives
- Kanamycine pBR322
Tableau 3 : Les vecteurs de co-expression employés.
Les différents vecteurs de la suite pET-MCN ainsi que leurs principales caractéristiques sont présentés. Dans le cas des vecteurs pnEA-tX, X représente n!importe quelle étiquette de purification.
Les tests de co-expression vont nécessiter la co-transformation d!un vecteur permettant l!expression d!une protéine native avec un vecteur permettant l!expression d!une protéine portant une étiquette de
purification.
b) Le vecteur pGexNB
Dans le cadre de la réalisation des tests de GST pulldown (présentés au paragraphe 2.3.2.1), les protéines ont été produites avec une étiquette de purification GST à leur extrémité amino-terminale. Pour la production de ces protéines, le vecteur pGexNB a été utilisé, qui dérive du vecteur pGEX 4T2 (commercialisé par GE Healthcare) qui a été modifié afin de contenir les sites de restriction NdeI et BamHI, permettant le clonage du gène de la protéine d!intérêt par restriction/ligation. Ce vecteur possède une origine de réplication pBR322, un gène de résistance à l!ampicilline et un promoteur tac. Ce promoteur est un hybride constitué du promoteur trp dans lequel la région -35 de la séquence de Shine-Dalgarno est remplacée par celle du promoteur LacUV5 (De Boer et al., 1983). La transcription à partir de ce
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promoteur est réalisée par la polymérase bactérienne, le système pouvant être réprimé par linhibiteur LacI et induit par lisopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (décrit au paragraphe 2.2.1). Ce vecteur peut être co-transformé avec les vecteurs pnCS, pnYC et pnEK de la suite pET-MCN, mais sa cassette ne peut être concaténée dans ces vecteurs.
c) Sous-clonage par restriction/ligation
Les sites de coupure par les enzymes de restriction qui ont été placés en 5 et 3 du gène codant pour la protéine lors de la PCR sont utilisés pour extraire les gènes du vecteur navette. Le produit de la digestion est alors déposé sur gel dagarose, les bandes correspondant à linsert sont découpées du gel et les fragments dADN sont extraits de lagarose avec le kit NucleospinÆ Extract II (Macherey Nagel). Le vecteur est quant à lui également digéré avec les mêmes enzymes, déphosphorylé avec la phosphatase SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas) pour éviter quil ne se recircularise et également purifié sur gel. Une réaction de ligation est alors réalisée avec la T4 DNA ligase (Epicentre) entre linsert et le vecteur ouvert en respectant un ratio molaire de 5 : 1 (insert : vecteur). Le produit de ligation est transformé au bout de deux heures dans des cellules DH5g et des clones sont isolés. La présence des inserts dans les vecteurs obtenus sont vérifiés par digestion. Le protocole de sous-clonage par restriction/ligation est présenté en annexe 8.1.3.1, page 261.
Les enzymes généralement utilisées au cours de ces sous-clonages sont NdeI (digestion en 5 du gène) et BamHI ou BglII (digestion en 3). Le clonage par restriction/ligation est généralement préféré à la recombinaison homologue puisque seuls trois résidus sont présents dans la protéine dintérêt après coupure par la protéase, tandis que ce sont neufs résidus qui restent fusionnés à la protéine dans le cas dune réaction de recombinaison homologue.
d) Sous-clonage par recombinaison homologue
La recombinaison homologue de type LR est parfois utilisée dans le cas du sous- clonage de gènes dans un vecteur pnEA-tH. Cette réaction est basée sur la reconnaissance entre deux sites attL1 et attL2 présents de part et dautre du gène dans le vecteur navette et deux sites complémentaires attR1 et attR2 présents dans le vecteur dexpression. Lenzyme LR clonase va catalyser léchange des deux brins (Figure 25), permettant le transfert du gène dans le vecteur dexpression. Le gène ccdB présent dans la cassette de clonage va permettre
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de sélectionner les vecteurs recombinés, ce gène étant échangé avec le gène d!intérêt. Le protocole de sous-clonage par restriction/ligation est présenté en annexe 8.1.3.2, page 261.
Figure 25 : Principe de la réaction LR d!un clonage Gateway
Les sites attL présents des deux côtés du gène dans le vecteur navette ont une séquence complémentaire aux sites attR présents dans le vecteur dexpression qui entourent un gène ccdB. La
LR clonase va cliver et échanger les deux brins. A la fin de la réaction, le vecteur dexpression contient le gène codant pour la protéine entouré de sites attB et le vecteur navette contient le gène
ccdB entouré de sites attP.
A l!issue de la réaction de recombinaison homologue, le gène codant pour la protéine est placé dans le vecteur en aval de l!étiquette de purification et du site de coupure par la protéase.