Purification des protéines

La purification des protéines est réalisée à partir des cultures réalisées précédemment. Seule létape de lyse diffère entre des protéines exprimées à partir de cultures bactériennes ou

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en cellules d!insectes. Différentes techniques permettent de purifier une protéine du milieu cellulaire dans lequel elle a été produite. Les protocoles mis en place comportent généralement une première étape d!affinité qui utilise l!étiquette de purification exprimée en fusion avec la protéine d!intérêt afin de la retenir sur une résine. Vient ensuite une étape de filtration sur gel qui permet d!augmenter la pureté de la protéine et notamment d!éliminer les aggrégats et/ou d!échanger le tampon dans lequel elle est purifiée. Cependant, des étapes d!échange d!ions peuvent s!avérer nécessaires, avant l!étape d!affinité, pour éliminer des contaminations par des acides nucléiques ou après l!étape d!affinité pour éliminer des contaminants protéiques qui peuvent être le résultat de la dégradation de la protéine. L!échangeuse d!ion est toujours suivie d!une étape de gel filtration ou de dialyse de manière à transférer la protéine dans un tampon connu. Cependant, dans le cadre de cette thèse cette technique n!a pas été utilisée et ne sera donc pas décrite.

2.2.5.1. 1ère étape : la lyse des cellules

1L de culture est resuspendu dans 50mL de tampon de lyse défini au cours des mini- tests d!expression et placé dans un bécher. Le bécher est placé sur la glace et les cellules sont soniquées avec un sonicateur. Les bactéries sont soniquées à une amplitude de 30% pendant un total de 3 minutes avec des impulsions de 5 secondes espacées de 5 secondes afin de permettre un refroidissement du milieu. Les cellules d!insectes sont soniquées à une amplitude de 30% au total 1 minute 30 secondes avec les mêmes impulsions que les bactéries, leurs membranes étant plus fragiles que les parois bactériennes. L!extrait total obtenu est centrifugé à 15000rpm pendant 45 minutes afin de précipiter les débris cellulaires et d!obtenir l!extrait soluble.

2.2.5.2. Chromatographie par affinité

La chromatographie par affinité est basée sur l!affinité particulière de l!étiquette de purification exprimée en fusion avec la protéine pour un ligand qui est couplé à une résine d!agarose ou de Sépharose. Les étiquettes de purification utilisées dans le cadre de cette thèse, leur ligand fixé à la résine et le mode d!élution employé pour chacune est présenté dans le Tableau 6.

101 Etiquette de purification Ligand couplé à la résine Mode d!élution de la

résine Référence des résines

Poly-histidine (His)6 Cobalt

Imidazole ou coupure par une protéase

TalonÆ Superflow de Clontech Glutathion-S-

Transférase (GST) Glutathion

Glutathion ou coupure par une protéase

Glutathione Sepharose 4B de GE Healthcare

Tableau 6 : Principales étiquettes de purification utilisées.

Les chromatographies d!affinité peuvent être réalisées soit sur des systèmes de chromatographie de type Akta, soit en vrac. C!est principalement la technique en vrac qui a été utilisée au cours de cette thèse et qui est donc décrite ici, le principe de ces deux méthodes étant identique.

a) Fixation de la protéine à la résine et lavages

Les résines fournies en vrac sont stockées dans de l!éthanol, le ratio d!éthanol et de résine étant de 1 : 1 dans le cas de la résine cobalt. L!éthanol en suspension est éliminé après centrifugation du mélange, la résine d!affinité sédimentant à faible vitesse (maximum 1000rpm). La résine sèche obtenue est ensuite équilibrée avec le tampon de lyse de la protéine puis incubée sous agitation avec l!extrait soluble à 4°C pendant 1h dans des falcon de 50mL. Les tubes sont ensuite centrifugés à basse vitesse (5 minutes à 1000rpm) afin de faire sédimenter la résine. Le surnageant, qui contient les protéines non retenues, est éliminé. La résine est alors reprise dans du tampon de lyse et placée dans une colonne Poly Prep (Bio- Rad). Un lavage de la résine avec du tampon de lyse est alors effectué afin d!éliminer les protéines liées aspécifiquement à cette résine. Les lavages sont poursuivis jusqu!à ce que l!éluat ne colore plus le réactif de Bradford (10µL d!éluat dans 250µL de réactif, le principe de cette technique étant décrit au paragraphe 2.2.5.4). La protéine est alors détachée de la résine soit par élution soit par coupure avec la protéase dont le site est placé entre l!étiquette de purification et la protéine d!intérêt.

b) Elution de la protéine

Dans le cas où la protéine est éluée, la résine est lavée dans un premier temps avec des concentrations faibles d!éluant afin de détâcher les protéines liées de manière aspécifique à la résine. Dans le cas où l!interaction entre la résine et l!étiquette de purification est faible, la protéine peut déjà être éluée à ces concentrations. Cependant, dans la plupart des cas, la protéine est éluée à des concentrations plus fortes d!éluants. Ainsi, dans le cas des protéines portant une étiquette de purification poly-His retenues par du Cobalt sur la résine, un premier

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lavage est généralement réalisé avec un tampon contenant 5mM d!imidazole, puis la protéine est éluée avec 250mM d!imidazole.

c) Elution par coupure de l!étiquette de purification

L!élution de la protéine par coupure de l!étiquette de purification permet d!obtenir une protéine plus pure. En effet lors de l!élution, les contaminants restants sont élués avec la protéine alors que, lorsqu!une protéase est utilisée, seule la protéine d!intérêt qui est fusionnée avec la séquence reconnue par la protéase est décrochée de la résine. La quantité de protéase ajoutée va être fonction de la quantité de protéine purifiée estimée. Ces protéases sont choisies du fait de leur haut degré de spécificité et de la faible occurrence des séquences qu!elles reconnaissent dans les séquences protéiques. Différentes protéases peuvent être utilisées : la thrombine, la TEV qui est une protéase issue du virus de la mosaïque du tabac (Tobacco Etch

Virus), le facteur Xa ou l!enzyme Précission (P3C).

C!est principalement la thrombine qui a été utilisée au cours de ce travail de thèse. Cette protéase reconnait spécifiquement la séquence protéique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser et coupe entre l!arginine et la glycine. Ce site de coupure est notamment codé par les vecteurs du Dr. Romier qui ont été utilisés (vecteur pnEA-tH). La protéase est ajoutée à la résine après l!étape de chromatographie d!affinité, la résine étant alors resuspendue dans le tampon de lyse et placée dans un falcon. Le volume dans lequel la résine est resuspendue doit être suffisamment important pour empêcher une précipitation des protéines du fait d!une trop forte concentration dans le tampon après coupure (généralement 3mL). Pour 1mg de protéine purifiée, 1U de thrombine à 1U/µL est ajoutée (MP Biomedicals). Les tubes sont placés sous agitation à 4°C pendant la nuit. Le lendemain la résine est placée dans les colonnes Poly-prep afin de récupérer l!éluat et de laver la résine jusqu!à ce que toute la protéine soit éluée. Un échantillon de résine après coupure permet généralement de vérifier que la coupure de l!étiquette de purification a bien été totale et que toute la protéine a pu être éluée.

La pureté des échantillons obtenus à l!issue d!une étape de chromatographie d!affinité n!est pas toujours suffisante pour la réalisation d!études structurales, c!est la raison pour laquelle au moins une étape de filtration sur gel est ajoutée. Par contre, la protéine obtenue peut être utilisée pour la réalisation de tests fonctionnels, et notamment d!expériences de pulldown, qui ont été réalisés au cours de cette thèse.

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2.2.5.3. Chromatographie dexclusion ou filtration sur gel

La filtration sur gel permet de séparer les molécules en fonction de leur taille et de leur encombrement par passage au travers dun tamis. Ce tamis est constitué de particules sphériques qui sont poreuses, la taille des pores dans une colonne étant variable mais comprise dans une certaine gamme. Trois types de molécules sont distinguées : (i) les molécules très encombrées qui sont trop grosses pour passer à travers les pores et passeront à lextérieur du tamis et qui sortiront les premières de la colonne, (ii) les molécules dencombrement faible qui passeront à travers tous les pores et seront donc fortement retardées et finalement (iii) les molécules dencombrement moyens qui passeront à travers certains pores et qui seront donc séparées en fonction de leur encombrement. La chromatographie dexclusion a été utilisée au cours de cette thèse pour la purification des protéines mais également pour le désalage déchantillons protéiques. Le désalage est réalisé sur un tamis ayant un volume dexclusion très bas, qui va retenir uniquement le sel et les petites molécules mais pas les protéines.

La réalisation dune chromatographie dexclusion pour la purification de protéines nécessite lutilisation dun système de chromatographie de type Akta (Purifier ou Express). Dans un premier temps, la colonne est équilibrée avec 1,2 volume (de colonne) de tampon. Léchantillon est ensuite injecté. Afin dobtenir la meilleure résolution possible des pics observés, le volume injecté ne doit pas dépasser un millième du volume de la colonne dans le cas des colonnes préparatives (S75 ou S200, GE Healthcare). Un système de détection UV permet didentifier rapidement les fractions contenant des protéines, un gel dacrylamide permettant de localiser la protéine dintérêt dans les fractions éluées.

Dans le cas des colonnes de désalage (qui ne nécessitent pas de systèmes de chromatographie) le volume déchantillon injecté peut représenter jusquà 20% du volume de la colonne.

La chromatographie dexclusion peut également être utilisée pour estimer le poids moléculaire apparent dune protéine (poids qui tient compte de lencombrement de la protéine). Cette estimation est réalisée en comparant le volume dexclusion de la protéine dintérêt au volume dexclusion de protéines de poids moléculaire connu. Cette observation peut notamment permettre de définir si la protéine est purifiée sous la forme dun monomère ou dun dimère.

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2.2.5.4. Concentration de léchantillon et estimation de sa concentration L!échantillon protéique obtenu à l!issue des étapes de chromatographie est généralement dilué, il doit donc être concentré avant la réalisation d!études structurales. Les échantillons sont concentrés sur des concentrateurs à membrane AmiconÆ Ultra. La membrane est poreuse et permet le passage des molécules en fonction de leur poids moléculaire et de leur forme. Les petites molécules d!eau, de sels et de tampon vont pouvoir passer au travers de la membrane alors que les protéines sont retenues au-dessus. Le volume de l!échantillon va ainsi être réduit sans perdre la protéine, conduisant donc à sa concentration. La membrane de ces systèmes de concentration va dans un premier temps être rincé avec le tampon de lyse de la protéine afin d!éliminer les traces de glycérol présentes. L!échantillon est ensuite chargé sur la membrane et le tube est centrifugé en plusieurs étapes de quelques minutes entre lesquelles la protéine est resuspendue. Ces étapes courtes permettent d!éviter que la protéine ne précipite sous l!effet du gradient de concentration qui se met en place au cours de la centrifugation. Lorsque la concentration voulue est atteinte, l!échantillon est prélevé sur la membrane puis utilisé pour les études structurales.

La concentration de l!échantillon peut être estimée, soit par la mesure de son absorbance à 280nm, soit en utilisant le réactif de Bradford.

La mesure de l!absorbance de l!échantillon à 280nm va permettre d!estimer la concentration de l!échantillon par l!utilisation de la loi de Beer Lambert. Cette loi relie l!absorbance mesurée à la concentration protéique en prenant en compte l!épaisseur du matériau traversé (en centimètres) et un coefficient d!extinction molaire " (en L.mol-1.cm-1). Ce sont le tryptophane et la tyrosine qui présentent un pic d!absorption à 280nm, le coefficient d!extinction molaire va donc être fonction du nombre de ces résidus présents dans la séquence protéique. Cependant ce coefficient ne sera qu!une estimation puisque le repliement de la protéine et le pH va également influer sur la capacité d!absorption des tryptophanes et donc sur la valeur du coefficient d!extinction molaire. Une détermination expérimentale de ce coefficient permet par conséquent le calcul exact de la concentration de la protéine. L!absorbance de l!échantillon protéique à 280nm va être mesurée sur le Nanodrop ND1000 dont est équipé le laboratoire.

Le réactif de Bradford contient du bleu de coomassie qui se lie aux acides aminés aromatiques présents dans la protéine. La fixation du bleu de coomassie sur ces résidus va induire un changement d!absorbance, la mesure étant réalisée à 595nm. Le changement

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d!absorbance observé va être proportionnel à la quantité de réactif lié à la protéine, permettant de déduire la quantité de protéines présentes dans le mélange. Cette concentration protéique va être déduite d!une courbe étalon généralement réalisée avec la protéine BSA (Bovine Serum Albumin). Le réactif de Bradford est dilué au 5ème dans de l!eau et entre 1 et 20µL de l!échantillon est ajouté à 1mL de réactif dilué placé dans une cuve de spectrophotomètre en plastique. L!absorbance à 595nm est alors mesurée sur le spectrophotomètre du laboratoire. La variation du volume de protéines mélangées va permettre de se placer dans la gamme de linéarité du réactif, comprise entre une absorbance de 0,2 et une absorbance de 0,8.

2.3. Caractérisation physico-chimique et