Résolution de structure par résonnance magnétique nucléaire

La résonnance magnétique nucléaire (RMN) est un phénomène physique très largement utilisé, notamment en imagerie médicale (IRM) où la résonnance des protons de l!eau est utilisée pour visualiser les tissus mous. Dans le cas de la RMN des protéines, ce sont également les atomes d!hydrogènes qui sont étudiés, ainsi que les atomes de carbone et d!azote. La résolution de la structure d!une protéine par RMN va nécessiter la mise en place de quatre étapes : (i) la production d!un échantillon marqué au carbone 13 et à l!azote 15, (ii) l!enregistrement des spectres di- et tridimensionnels, (iii) l!assignement des résonnances de chaque atome de la protéine et (iv) le calcul de la structure de la protéine. Au cours de cette thèse, la structure du complexe protéique TFIIS/Spt8 a été résolue par RMN avec l!aide du Dr. Christian Koehler de l!équipe de RMN biomoléculaire du Dr. Bruno Kieffer.

2.4.2.1. Principe

a) La résonnance magnétique nucléaire

La résonnance magnétique nucléaire utilise une propriété des atomes possédant un spin égal à ½, ces spins étant répartis en deux états de spin +½ et "½ sous l!effet d!un champ électromagnétique (Figure 37). Différents atomes peuvent être considérés pour réaliser ces mesures et notamment l!hydrogène 1H, le carbone 13C et l!azote 15N. Lorsque ces atomes sont placés dans un champ magnétique Bo chaque état de spin va correspondre à un niveau d!énergie (Figure 37), la fréquence ou moment cinétique de chacun de ces spins est alors fonction du champ Bo.

123

Figure 37 : Etat des spins nucléaires en absence et en présence d!un champ magnétique.

Un atome de spin ½ (cas de 1H, 13C et 15N) possède deux états de spin : +½ et ½ (cas Bo=0) en

labsence de champ magnétique. Lorsque cet atome est placé dans un champ magnétique (cas Bo>0),

chaque état de spin va adopter un niveau dénergie, létat de plus faible énergie présentant un léger excès de population. Limpulsion nécessaire au passage des spins des niveaux de basse énergie vers

les niveaux de haute énergie est égale à E=h et est fonction de l!atome considéré.

Au cours dune expérience de RMN, léchantillon soumis au champ initial Bo va être soumis par impulsion à un second champ magnétique B1 perpendiculaire au champ Bo. Lénergie E de cette impulsion est égale à la différence entre les deux niveaux dénergie. Cette seconde impulsion va rompre léquilibre qui existe entre les spins peuplant les deux niveaux dénergie, induisant une augmentation de la population du niveau dénergie le plus élevé. Le phénomène de relaxation décrit le retour des spins de basse énergie à leur état initial (Figure 38).

Figure 38 : Mesure et exploitation du phénomène de relaxation

Le retour du spin à son niveau initial va induire des fluctuations de la magnétisation dans le temps qui vont être enregistrés. La transformée de Fourier va permettre de transformer le signal afin qu!il soit

124

C!est la fréquence de résonnance des spins au cours du phénomène de relaxation qui est mesurée au cours de l!expérience de RMN (mesurée en Hertz). Le déplacement chimique h (en partie par million, ppm) va être déduit de la fréquence de résonnance du noyau considéré. L!environnement chimique de l!atome considéré, va fortement influencer ce déplacement. Le signal enregistré va donc contenir les informations de tous les noyaux excités présents dans la molécule. La Transformée de Fourier va être utilisée pour extraire le signal de chaque proton du signal sigmoïdal obtenu (Figure 38).

b) Application à la résolution de structures de protéines

La détermination de la structure d!une protéine par RMN va nécessiter la réalisation d!expériences hétéronucléaires. En effet, le grand nombre d!atomes présents dans la molécule biologique, notamment les protons, conduirait dans le cas d!expériences homonucléaires à la superposition des pics rendant les spectres inexploitables. L!enregistrement des spectres va alors nécessiter l!application de séquences d!impulsions complexes. Ces impulsions vont permettre le transfert de l!aimantation d!un atome d!hydrogène vers les atomes d!azote ou de carbone présents à proximité. Ces transferts peuvent être réalisés soit (i) le long des liaisons atomiques, donnant une information sur les atomes directements reliés à l!atome considéré soit (ii) directement aux atomes présents dans l!environnement proche de l!atome ayant subi l!excitation (moins de 5Å) et constitue l!effet Overhauser (effet NOE). Ainsi pour chaque atome d!hydrogène, de carbone et d!azote, une valeur de déplacement chimique h en ppm va pouvoir être définie. La connaissance de ces valeurs de déplacement chimique et l!observation des effets Overhauser va permettre de définir des contraintes de distance entre les atomes de la protéine. Plusieurs structures qui répondent à ces contraintes ainsi qu!aux contraintes topologiques des protéines (longueur de liaison, angles dièdres, stéréochimie ") vont ainsi pouvoir être calculées.

2.4.2.2. Préparation de léchantillon et enregistrement des spectres

Le complexe marqué avec du 13C et du 15N est produit puis purifié selon les protocoles décrits précédemment. Le tampon de lyse utilisé contient 50mM NaCl et 10mM d!un tampon phosphate (couple Na2HPO4/NaH2PO4) à pH7. La mesure de spectre RMN va nécessiter 300µL d!échantillon à environ 200µM auquel 10% d!eau deutérée (D20) est ajouté. Après centrifugation, l!échantillon est placé dans un tube fin en verre de type Shigemi, l!échantillon devant avoir une hauteur de 5cm dans ce tube. Le tube est alors placé dans un spectromètre

125

Brucker 700MHz. Les spectres sont enregistrés à 300K afin de favoriser les transferts d!aimantation.

Différents types de spectres sont enregistrés :

- Des spectres à deux dimensions 1H-15N et 1H-13C qui vont permettre d!observer la corrélation entre les atomes d!azote et d!hydrogène et de carbone et d!hydrogène respectivement. Dans le spectre 1H-15N, un pic de corrélation est observé pour chaque groupement amide de la liaison peptidique (un pic par résidu) ainsi que pour les chaînes latérales des résidus possédant des groupements amides (asparagine, glutamine, tryptophane). Ce spectre constitue la signature d!une protéine.

- Des spectres à trois dimensions vont permettre de réaliser l!attribution séquentielle des déplacements chimiques. Ces spectres ainsi que les corrélations observées sont présentés dans le Tableau 7. Les spectres utilisés pour l!attribution séquentielle sont colorés, ceux colorés de manière identique étant comparés ensemble.

- Deux spectres à trois dimensions NOESY (15N et 13C) vont permettre l!observation des effets NOE, qui donnent une information sur les atomes proches dans l!espace de l!atome considéré

126

Spectre N dimensions Corrélation

15

N-HSQC 2D Azote et hydrogène liés covalements

13

C-HSQC 2D Carbones et hydrogènes liés covalements

HNCA 3D Hydrogène de la chaîne principale avec les C-alpha des résidus suivants et précédents

HNCOCA 3D Hydrogène de la chaîne principale avec les C-alpha des résidus précédents

HNCACB 3D Hydrogène de la chaîne principale avec les C-alpha et C-béta des résidus suivants et précédents

CBCACONH 3D Hydrogène de la chaîne principale avec les C-alpha et C-béta des résidus précédents

HNCO 3D Hydrogène de la chaîne principale avec le carbone du

groupement carbonyle des résidus précédents

HNCACO 3D Hydrogène de la chaîne principale avec le carbone du groupement carbonyle des résidus suivants et précédents

HBHACONH 3D Hydrogène de la chaîne principale et H-alpha et H-béta de la chaîne latéral du résidu précédent

COSY 3D Hydrogènes de la chaîne latérale avec hydrogènes de rang +1 et -1

TOCSY 3D Tous les hydrogènes des chaînes latérales

15

N-NOESY 3D A partir de l!azote de la chaîne principale ou des chaînes