Brève description des résultats

Cette partie a pour but de présenter succinctement les résultats décrits dans la publication numéro 1 (paragraphe 3.3, page 141).

Les bornes d!un fragment codant pour l!extrémité carboxy-terminale et contenant le domaine SH2 des protéines Spt6 d!Encephalitozoon cuniculi et Antonospora locustae ont été déterminées à partir d!un alignement multiple de séquences. Les gènes codant pour ces fragments ont ensuite été clonés dans les vecteurs pnEA-tH, permettant d!exprimer les protéines en fusion avec une étiquette de purification poly-(His) à son extrémité amino- terminale. Ces protéines ont été produites dans la bactérie, purifiées et utilisées pour des essais de cristallisation. Des cristaux ont été obtenus à partir de la construction de la protéine

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dAntonospora locustae (Figure 42), permettant de résoudre la structure de la protéine par la méthode MIRAS.

Figure 42 : Cristaux du domaine carboxy-terminal de la protéine Spt6 dAntonospora locustae

Cristaux de la construction (783-957) de la protéine Spt6 d!Antonospora locustae (groupe d!espace P21212, résolution 2,2Å)

Cette structure a révélé que le domaine carboxy-terminal de Spt6 contient en fait deux domaines SH2 de type Src (Tableau 8) organisés en tandem. Le premier de ces domaines SH2 (SH21) possède les principaux éléments caractéristiques de ces domaines. Cependant, la poche de fixation de la phosphotyrosine de ce domaine est moins profonde et donc serait plus adaptée à la reconnaissance dun résidu phosphosérine. La poche de spécificité de ce domaine est formée en partie par des résidus de la boucle BC du second domaine SH2 (SH22) et de lhélice gB du domaine SH21 qui est plus longue que dans les domaines SH2 standards. Le second domaine SH2 (SH22) est par contre non canonique. Larginine B est remplacée par une tyrosine qui ne pointe pas vers la poche de fixation de la phosphotyrosine alors que larginine gA et la lysine D qui réalisent les interactions de type amino-aromatique sont remplacés par une alanine et une tyrosine respectivement. Lorientation de la boucle BC et la présence dune sérine dans cette boucle indique que des interactions électrostatiques peuvent être formées avec un groupement phosphate. De plus, la poche de spécificité ne peut être détectée à la surface de ce domaine. Ainsi, la très forte divergence de ce domaine SH22 explique pourquoi ce domaine na pas été détecté au niveau de la séquence de la protéine et amène la question de son rôle dans la fonction de Spt6.

Dans chacune des poches de fixation des phosphotyrosines, un ion sulfate peut être placé dans la densité électronique indiquant que les deux domaines SH2 ont conservé leur capacité à fixer des ions phosphates. Dans le premier domaine SH2, la fixation de cet ion

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sulfate est compatible avec le mode de fixation du groupement phosphate des domaines SH2 standards. Cet ion sulfate est ancré moins profondément dans le domaine puisque la poche de fixation est moins profonde. Dans le second domaine SH2, par rapport aux domaines SH2 standards, seule la boucle BC participe à la fixation de l!ion. Cet ion réalise également des interactions électrostatiques avec un résidu du brin C et la tyrosine du brin D qui remplacent la lysine réalisant normalement l!interaction de type amino-aromatique, ce mode de liaison étant tout à fait atypique. Ainsi, bien que très divergent des domaines SH2 dits standard, ce second domaine SH2 semble avoir conservé la capacité à reconnaitre des groupements phosphates.

Afin de tester l!implication de chacun de ces domaines dans la liaison à l!ARN polymérase II, des expériences de GST pulldown ont été réalisées sur des extraits de levure. Les constructions des domaines carboxy-terminal des protéines Spt6 d!A. locustae, E.

cuniculi, S. cerevisiae et de la protéine humaine ont été clonées dans un vecteur pGEX,

permettant l!expression de ces domaines en fusion avec une étiquette de purification GST. De même, des mutations ont été introduites au niveau des résidus impliqués dans la fixation de l!ion sulfate dans le domaine carboxy-terminal de la protéine Spt6 de levure. La présence de l!ARN polymérase II dans la fraction retenue au cours des expériences de pulldown est révélée par Western Blot en utilisant des anticorps dirigés contre le domaine carboxy-terminal de la plus grande sous unité de l!ARN polymérase II, cet anticorps reconnaissant indifféremment les formes hypo- et hyperphosphorylées (anticorps 7C2) (Besse et al., 1995). Ces expériences de pulldown ont révélé que les domaines carboxy-terminaux, contenant les deux domaines SH2 des protéines Spt6 des différents organismes testés permettaient de retenir l!ARN polymérase II. De plus, l!absence de l!un de ces domaines abolit l!interaction alors que la mutation des résidus impliqués dans la fixation de l!ion sulfate ne fait que l!affaiblir. La réalisation de western blots avec des anticorps reconnaissant spécifiquement l!état hyperphosphorylé sur les sérines 2 (anticorps H5) ou sur les sérines 5 (anticorps H14) indique que le domaine carboxy-terminal de la protéine Spt6 de levure reconnaît préférentiellement le CTD de l!ARN polymérase II phosphorylé sur ces sérines 2.

Afin de comprendre le rôle de ces deux domaines SH2 dans un contexte biologique, des études de génétique de levure ont été réalisées par nos collaborateurs de l!équipe de Fred Winston à la Harvard Medical School de Boston. L!expression dans la levure de versions de la protéine dans lesquelles le domaine SH22 ou les deux domaines SH2 ont été délétés conduit

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à l!apparition de phénotypes thermosensibles, de phénotype Spt- et à l!initiation de la transcription à partir de sites cryptiques. L!apparition de ces phénotypes montre le rôle très important du domaine carboxy-terminal de Spt6 et confirme l!importance fonctionnelle du second domaine SH2 dont la divergence suggérait un rôle fonctionnel éventuellement moins important.

La connaissance de la structure du domaine carboxy-terminal de Spt6 a permis d!établir un modèle de l!interaction entre le tandem SH2 de Spt6 et le CTD phosphorylé de l!ARN polymérase II. Afin de valider ce modèle, des peptides contenant deux répétitions du motif Y-S-P-T-S-P-S phosphorylés sur les différentes sérines ont été synthétisés. Leur capacité à lier le domaine carboxy-terminal de Spt6 a été testée par microcalorimétrie et Thermofluor. Cependant aucune interaction n!a pu être détectée par aucune de ces techniques. L!ensemble de nos résultats montrent donc que la reconnaissance de l!ARN polymérase II par Spt6 fait appel à des mécanismes compliqués qu!il reste à mettre en évidence.