Production des protéines en grand volume dans un système exogène

La réalisation d!études structurales par cristallographie va nécessiter la production de grandes quantités de protéine, ce qui ne peut être obtenu que par la surexpression dans un organisme hôte. De plus, dans certains cas, les protéines produites doivent être marquées. C!est notamment le cas lors de la réalisation d!études structurales par résonnance magnétique nucléaire au cours desquelles de l!azote 15 et/ou du carbone 13 doivent être incorporés à la

98

protéine ou encore lors de l!introduction de sélénométhionines dans la protéine pour la résolution du problème des phases en cristallographie. Différents milieux de culture vont permettre de cultiver des bactéries qui sont présentées dans cette section.

2.2.4.1. Production en bactéries

Une fois les conditions définies lors des tests d!expression et de co-expression, des cultures bactériennes en grand volume sont réalisées. Ces cultures peuvent être réalisées soit en fioles de 5L, dans lesquelles 1L de culture est placé, soit en fermenteur de plusieurs litres (typiquement plus de 5L de culture). De la même manière que pour les tests d!expression, différents milieux peuvent être utilisés et, là encore, une étape d!optimisation peut s!avérer nécessaire. Les différents milieux utilisés sont présentés dans le paragraphe 2.2.2, page 87. De plus, d!autres paramètres peuvent être modifiés, tels que (i) la densité optique de la culture lors de l!induction, (ii) la température lors de la production, qui est généralement baissée causant un ralentissement de la croissance bactérienne et favorisant le repliement des protéines produites et par conséquent de notre protéine d!intérêt ou (iii) le temps de production, ce qui est notamment le cas lors de la production de protéines toxiques ou de protéines formant rapidement des corps d!inclusion. Ces paramètres vont notamment jouer un rôle sur le taux de production des protéines et sur leur repliement.

La première étape de la production de protéines est la transformation du plasmide codant pour la protéine (ou des plasmides dans le cas de la production de complexes protéiques) dans la bactérie. Cette transformation est réalisée par choc thermique (45 secondes à 42°C) dans des bactéries BL21(DE3) rendues chimiocompétentes par traitement au chlorure de calcium. Cette transformation est ensuite étalée sur LB-Agar contenant les antibiotiques nécessaires dilués au 1000ème. Dans le cas où des bactéries contenant un plasmide pRARE2 sont utilisées, le vecteur est déjà présent dans la bactérie (il a été introduit lors de la préparation des bactéries compétentes) afin d!augmenter le taux d!efficacité de la transformation. Le lendemain, quelques colonies sont repiquées et utilisées pour restrier un milieu LB-Agar contenant également les antibiotiques dilués au 1000ème afin d!assurer une bonne sélection des bactéries et pouvoir observer les contaminations phagiques qui auraient pu avoir lieu. Le jour de la réalisation de la culture, les bactéries sont remises en suspension dans un milieu LB liquide, leur densité optique à 600nm est mesurée afin de déterminer quel volume utiliser pour inoculer la culture.

99

Le lendemain, les cultures sont centrifugées pour éliminer le milieu de culture et les bactéries sont resuspendues dans le tampon de lyse adapté à la protéine exprimée (qui a été déterminé au cours des tests d!expression). Si ce tampon n!est pas connu, une fraction de la culture est prélevée et un test d!expression est réalisé avec différents tampons afin de déterminer quel tampon utiliser. Ce type de tests permet également de vérifier que la protéine a bien été produite et d!estimer son taux de production ce qui permettra par la suite d!estimer le volume de résine d!affinité à utiliser lors de la purification. Une fois les cellules resuspendues, elles sont congelées à -20°C.

2.2.4.2. Production en cellules dinsectes

La production dans les cellules dinsectes est réalisée par la plateforme de lIGBMC. Dans un premier temps, lorsque le bacmide est fourni à la plateforme, il est utilisé pour transformer des cellules Sf9 qui sont des cellules ovariennes du papillon Spodoptera

frugiperda. Ces cellules vont ainsi produire le virus recombinant qui exprime la protéine

dintérêt. Le virus est alors purifié et utilisé afin de réaliser les premiers tests dexpression qui permettent de vérifier que la protéine est exprimée et soluble. Le protocole de purification à partir de ces tests est identique à celui des tests réalisés à partir de bactéries, les cellules étant cultivées en monocouche dans des grands flacons. Le milieu de culture utilisé est le Graces Insect Cell SigmaÆ complémenté avec 10% de sérum f!tal bovin et de 28mg/mL de gentamycine les cellules étant cultivées à 27°C.

Si la protéine est exprimée et soluble, de nouveaux tests dinfection sont réalisés qui permettent de définir la quantité de virus nécessaire à linfection des cellules (MOI, Multiplicity Of Infection) et le temps de culture nécessaire (48h ou 72h) pour que la culture soit optimale. En effet, une plus grande quantité de virus permettra de sassurer que chaque cellule a été infectée et ainsi dobtenir une meilleure expression. En fonction de ces tests, des cultures dun litre sont réalisées en suspension.

Pour ces grandes cultures, le milieu de culture est éliminé après centrifugation à faible vitesse (15 minutes à 1200rpm) car les cellules sont fragiles, elles sont ensuite resuspendues dans le tampon de lyse et congelées à -20°C.