Rôle de Ntr1p dans la biogenèse des ribosomes

Ntr1p est requise pour la fonction de Prp43p dans l’épissage. Nous voulions savoir si elle était aussi nécessaire à la fonction de Prp43p dans la biogenèse des ribosomes. Pour répondre à cette question, il fallait tester si Ntr1p participait à la biogenèse des ribosomes.

Pour commencer, nous voulions étudier l’effet de l’inhibition de l’expression de cette protéine sur la maturation des pré-ARNr. Là encore, nous nous sommes heurtés à un problème technique. En effet, la souche Tet ::NTR1 permettant la répression de l’expression de Ntr1p en présence de doxycycline s’est avérée inutilisable. Car, en présence de cette drogue, les cellules continuaient de se multiplier normalement. Ce phénomène peut s’expliquer par la faible quantité de Ntr1p requise pour la viabilité cellulaire (556 molécules par cellule). Nous avons par la suite construit un plasmide centromérique permettant

Figure 36 : Analyse des ARN issus de l’IP Ntr1p-TAP

Les ARN issus des IP réalisées à partir des souches sauvages (BY4741) ou de la souche exprimant Ntr1p-TAP sont analysés. Soit par extension d’amorce (35S, 27SA2 et 27SB) ou

Nothern-blot (25S, 18S, snARN U2 et snARN U5). L’efficacité des IP est évaluée en comparant le signal provenant des extraits totaux (Tot) au signal issu des IP (IP). Il est à noter qu’il y a un rapport de 150 entre ce qui est déposé dans la piste Tot et ce qui est déposé dans la piste IP.

Figure 37 :Purification TAP de la protéine Ntr1p-TAP

Analyse sur gel 12% des protéines, issues des purifications TAP, colorées au bleu colloïdal. Mq : Marqueur de taille ; Ct : souche BY4741.

Tableau 6 : Présentation des protéines issues de l’IP Ntr1p-TAP

Résumé sous la forme d’un tableau de la répartition des protéines issues de la purification en fonction de leur intervention dans un processus.

RNP Protéines co-purifiées avec Ntr1p-TAP RNP Protéines co-purifiées avec Ntr11p-TAP Complexe d’épissage Prp8p Brr2p Snu114p Syf1p Cef1p Clf1p Pso4p Prp46p Prp45p Ntr2p Cwc23p Ded1p Autres Cdc40p Ssc1p Pbp1p Eno2p

Figure 38 : Ntr2p n’est pas requise pour la biogenèse des ribosomes.

A-Les ARN issus des IP réalisées à partir des souches sauvages (BY4741) ou de la souche

exprimant Ntr1p-TAP sont analysés. Soit par extension d’amorce (35S, 27SA2 et 27SB) ou

nothern-blot (25S, 20S, 18S et snARN U5). L’efficacité des IP est évaluée en comparant le signal provenant des extraits totaux (Tot) au signal issu des IP (IP). Il est à noter qu’il y a un rapport de 150 entre ce qui est déposé dans la piste Tot et ce qui est déposé dans la piste IP.

B-Le niveau des pré-ARNr extraits à partir des cellules, dont l’expression de Ntr2p est

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l’expression de Ntr1p sous contrôle d’un promoteur GAL. Il reste à tester cette construction dans une souche !ntr1.

Ensuite, nous avons testé l’association de Ntr1p avec les particules pré-ribosomiques. Or, que ce soit par l’analyse des ARN ou l’identification des protéines co-immunoprécipités avec Ntr1p-TAP, aucune association avec ces particules n’a pu être mise en évidence. Ainsi, il n’y a pas de différence de quantité des pré-ARNr présents après l’IP réalisée à partir de la souche sauvage (BY4741) ou de la souche Ntr1p-TAP (figure 36, pistes 2 et 4). Alors que, lors de la même expérience, l’IP réalisée à partir d’extraits de la souche Ntr1p-TAP permet de retenir spécifiquement le snARN U5 en comparaison avec l’IP réalisée à partir de la souche sauvage (figure 36, pistes 6 et 8). Ce dernier résultat est en accord avec l’association spécifique entre Ntr1p et la snRNP U5 mise en évidence récemment (Tsai et al., 2007). De même, parmi les facteurs co-purifiés avec Ntr1p-TAP, aucun n’est lié à la biogenèse des ribosomes (figure 37 et tableau 6). Ceci ne doit pas être dû à des problèmes de purification, car on retrouve beaucoup de facteurs impliqués dans l’épissage, surtout des membres du « nineteen complex » (NTC) dont Ntr1p est un composant (Tsai et al., 2005; Tsai et al., 2007).

Prp43p est associée à Ntr1p et Ntr2p lorsqu’elle intervient dans l’épissage. Nous voulions nous assurer que la composante Ntr2p ne jouait pas de rôle dans la biogenèse des ribosomes. Pour cela, nous avons tout d’abord analysé les ARN co-purifiés spécifiquement avec Ntr2p-TAP. Cette expérience montre que Ntr2p-TAP, par rapport à une souche sauvage, ne retient spécifiquement aucun pré-ARNr (figure 38a, pistes 2 et 4), alors qu’elle s’associe spécifiquement avec le snARN U5 (figure 38a, pistes 6 et 8). De plus, l’inhibition de l’expression de Ntr2p, sous le contrôle d’un promoteur Tet, ne provoque pas de perturbation rapide et importante de l’accumulation des pré-ARNr et des ARNr matures (figure 38b). Ntr2p n’est donc pas impliquée dans la maturation des pré-ARNr.

L’ensemble de ces résultats indique que ni Ntr1p ni Ntr2p ne sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes. Cependant ces protéines, qui sont nécessaires à la fonction de Prp43p dans l’épissage, sont spécifiquement associées au complexe d’épissage, et plus particulièrement à la snRNP U5. Ces données corroborent des résultats récents qui démontrent que Prp43p s’associe au complexe d’épissage par l’intermédiaire de Ntr1p et de Ntr2p, eux-mêmes recrutées via la snRNP U5 (Tsai et al., 2007).

Figure 39 : Tests d’interactions in vitro entre Gno1p, Pfa1p et Prp43p

A- Les expressions de Pfa1p-his et de Prp43p-his sont testées par western-blot en utilisant des

anticorps dirigés contre l’étiquette His (!-His), pistes 1 et 2. Ensuite, les extraits solubles contenant ces protéines sont mélangés (ou utilisés directement), puis incubés avec des billes couplées à des anticorps !-Prp43. La rétention de Pfa1p-his et de Prp43p-his sur ces billes est testée par western-blot !-His, pistes 3 et 4. B- La même expérience que pour pfa1p-his est réalisée, en remplaçant Pfa1p-his par Gno1p-his C- Les expressions de Pfa1p-his et de Prp43p-his sont testées par western-blot dirigés contre l’étiquette His (!-His), piste 1 et 2. Ensuite, les extraits solubles contenant Gno1p-GST, GST, Pfa1p-his et Prp43p-his sont mélangés (ou utilisés directement), puis incubés avec des billes de glutathione sépharose. La rétention de Pfa1p-his et de Prp43p-his sur ces billes est testée par western-blot !-His, pistes 3, 4, 5 et 6.

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Ces différentes expériences nous ont permis d’établir que seules les protéines à G- patch Gno1p et Pfa1p pouvaient réguler la fonction de Prp43p dans la biogenèse des ribosomes. Nous nous sommes donc focalisés sur l’étude de ces protéines.