Gno1p et Pfa1p sont capables de moduler l’activité ATPase de Prp43p in vitro

in vitro

Dans un premier temps, nous avons voulu tester l’activité de Prp43p seule afin de vérifier que l’on obtenait les mêmes activités que celles décrites précédemment. Pour cela nous avons produit Prp43p-his, puis purifié cette protéine en deux étapes sur colonne d’affinité (NI-NTA) puis sur tamis moléculaire. Nous avons obtenu une grande quantité de protéine pure (environ 1,5 mg) (figure 44a). Ensuite, nous avons testé l’activité ATPase de cette protéine par chromatographie sur couche mince. Nous avons ainsi vérifié que l’activité ATPase de Prp43p était spécifiquement induite par ajout d’ARN dans le milieu réactionnel

(figure 44b). Ceci est en accord avec les dernières données structurales des hélicases qui

montrent que la fixation d’ARN induit des changements conformationnels qui améliorent l’activité ATPase de ces protéines. Finalement, nous avons quantifié l’effet de l’ARN sur l’activité ATPase de Prp43p. Nous avons établi une constante catalytique (Kcat) et une constante d’affinité (Km) en fonction de la présence d’ARN (figure 44c). Le Km obtenu en présence d’ARN est le même que celui trouvé par l’équipe de Béate Schwer (Tanaka and Schwer, 2006). En revanche notre Kcat est inférieur à celui obtenu par cette équipe. Ceci peut s’expliquer par l’utilisation d’un ARN optimal (polyA) dans leurs expériences, alors que nous avons utilisé des ARN totaux de levure, dont la nature est beaucoup moins homogène.

Figure 44 : Activité ATPase de Prp43p

A- Contrôle de la purification de Prp43p-his sur gel, avec une coloration argent ou un

western-blot !-His(HRP). B- Analyse par chromatographie sur couche mince de l’effet sur l’activité ATPase de Prp43p (100nM) de différents acides nucléiques (15µM). C- Quantification des constantes d’activité de Prp43p (Km et Vmax) avec les méthodes de Mickaelis-Menten et Lineweaver-Burk, ici Prp43p est utilisée à 100nM et l’ARN à 150µM).

B

C

A

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Une fois ces vérifications terminées nous avons examiné l’effet de l’ajout des partenaires Gno1p et Pfa1p dans le milieu réactionnel. Pour cela, nous avons produit puis purifié les protéines Gno1p-GST et Pfa1p-his. Ces deux purifications ont été réalisées en deux étapes : sur colonne d’affinité puis sur tamis moléculaire. Dans les deux cas, nous avons réussi à obtenir une quantité satisfaisante de protéines (environ 500ug). Cependant les colorations à l’argent révélaient de nombreuses bandes qui se sont avérées être des produits de dégradation, car elles étaient révélées par western-blot (figure 45a). Ces dégradations pourraient provenir d’un manque de stabilité de ces protéines en absence de Prp43p. En effet, lorsque l’on ajoute cette protéine aux préparations, Gno1p-GST et Pfa1p-his se stabilisent. Nous avons ensuite testé l’effet de l’ajout de ces protéines dans le milieu réactionnel, d’abord en absence puis en présence d’ARN.

Les premiers résultats obtenus en absence d’ARN, traités par les représentations de Mickaelis-Menten ou de Lineweaver-Burk, nous ont permis de conclure que Pfa1p et Gno1p stimulent l’activité ATPase de Prp43p (figure 45b). Ainsi, lorsque l’on ajoute dans les mêmes conditions (500nM de partenaire pour 100nM de Prp43) les protéines Gno1p-GST ou Pfa1p- his on observe que la Kcat augmente de la même manière : la Kcat de Prp43p augmente de 0,97 min-1 à 25,6 min-1 en présence de Gno1p-GST et 20,9 min-1 en présence de Pfa1p-his

(figure 45b). Dans les mêmes conditions, l’ajout de la GST seule n’affecte pas l’activité

ATPase de Prp43p, et Gno1p-GST ou Pfa1p-his seule sont incapables d’hydrolyser l’ATP (non montré). En revanche, il y a plus de différences entre les Km obtenus (figure 45b). Ces variations peuvent provenir d’une différence dans la liaison de ces partenaires et les changements conformationnels qui en résultent et/ou d’une différence de pureté ou d’état d’oligomérisation de ces protéines. Il est néanmoins intéressant de noter que l’activité enzymatique (Kcat/Km) est dans les deux cas augmentée (de 16 fois en présence de Gno1p et de 5 fois en présence de Pfa1p). Nous avons alors voulu savoir si la stimulation de l’activité ATPase provenait de l’augmentation de la fixation ou de l’hydrolyse de l’ATP. Pour cela nous avons réalisé des pontage covalents d’!P32ATP par Prp43p, induits par exposition aux UV, en présence de concentration croissante des partenaires à G-patch. Suite à l’ajout de ces protéines aucune augmentation dans la quantité d’ATP fixée par Prp43p n’a été observée

(figure 45c). Nous avons même remarqué qu’en présence d’une grande concentration de

Pfa1p-his nous obtenions une fixation de l’ATP moins efficace. Ces résultats suggèrent que les protéines Gno1p-GST et Pfa1p-his agissent plutôt sur l’hydrolyse d’ATP par Prp43p-his.

Puis nous avons réalisé les mêmes expériences en présence d’ARN. De manière très surprenante, nous avons alors obtenu des effets différents après ajout de Gno1p-GST ou de

Figure 45 : Effets des protéines Pfa1p et Gno1p sur l’activité ATPase de

Prp43p en absence d’ARN

A- Contrôle de la purification de Pfa1p-his et de Gno1p-GST sur gel, avec une coloration

argent ou un western-blot avec un !-His(HRP) ou un !-GST. B- Quantification des constantes d’activité de Prp43p-his en présence de quantité croissante de Gno1p ou de Pfa1p (ATP à 100µM) avec les méthodes de Mickaelis-Menten et Lineweaver-Burk. C- Test de liaison covalente d’ATP par Prp43p (1µM) en présence de quantité croissante de Gno1p-GST ou de Pfa1p-his (de 0.5 à 1µM). Mickaelis-Menten Lineweaver-Burk Km(µM) Kcat(min-1) Km(µM) Kcat(min-1) Prp43p-his 14.5± 1.8 0.96±0.02 16 0.97 Prp43p-his + Gno1p-GST 46.2±16.8 28.9±2.2 25.9 25.6 Prp43p-his + Pfa1p-his 335.1±78.8 36±2.9 81.5 20.9

A

B

C

Figure 46 : Effets des protéines Pfa1p et Gno1p sur l’activité ATPase de

Prp43p en présence d’ARN

Représentation de l’activité ATPase de Prp43p-his (100nM) en présence de Gno1p (500nM) et de Pfa1p (500nM), avec les méthodes de Mickaelis-Menten et Lineweaver-Burk.

Figure 47 : Etude de l’activité ARN hélicase de Prp43p en présence de

Gno1p et de Pfa1p

A- Tests hélicase réalisés sur deux types de substrats (1nM) permettant d’analyser l’activité

ARN hélicase de Prp43p (100nM) dans les deux directions (5’-3’ et 3’-5’) en présence de ses partenaires à domaine G-patch (500nM) et d’ATP (1mM). B- Test de l’ajout de Gno1-GST (1 à 500nM) sur l’activité hélicase de Prp43p-his (100nM) obtenue en présence de Pfa1p (50nM).

B

A

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Pfa1p-his. En effet comme en absence d’ARN, Pfa1p-his augmente l’activité ATPase de Prp43p (figure 46). Nous sommes cependant à présent incapables d’évaluer les différentes valeurs concernant cette activation, car les deux derniers point obtenus sur la représentation de Mickaelis-Menten sont très décalés par rapport à la courbe, ce qui indique une trop grande variation entre les données expérimentales et les valeurs prédites par cette methode. Il sera nécessaire de refaire ces expériences. A la différence de Pfa1p-his, l’ajout de Gno1p-GST ne permet pas d’augmenter l’activité ATPase de Prp43p en présence d’ARN. De manière frappante, la représentation de Lineweaver-Burk nous permet d’observer un croisement entre les courbes correspondant à Prp43p-his d’une part et à Prp43p-his en présence de Gno1p-GST d’autre part sur l’axe des ordonnées en présence d’ARN (figure 46). Or ce croisement est typique d’une compétition entre deux facteurs dans la réaction, autrement dit Gno1p-GST pourrait rentrer en compétition avec l’ARN pour la liaison à Prp43p-his. Il sera pourtant nécessaire de réaliser d’autres expériences afin de confirmer cette interprétation.

Ainsi Gno1p-GST et Pfa1p-his sont capables d’augmenter l’activité ATPase de Prp43p en absence d’ARN. Alors que seule Pfa1p-his est capable d’augmenter l’activité ATPase de Prp43p liée à l’ARN.