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1. Pfa1p n’est pas nécessaire à l’association de Prp43p avec les particules pré-ribosomiques
Tout d’abord, nous avons voulu examiner l’impact de l’absence de Pfa1p sur la localisation de Prp43p. Pour cela, nous avons réalisé des expériences d’immunolocalisation avec des anticorps dirigés contre Prp43p et contre Nop1p (afin de visualiser le nucléole). Nous avons comparé les signaux obtenus à partir d’une souche sauvage ou d’une souche !pfa1. Prp43p se trouve bien majoritairement localisée dans le nucléole, dans les cellules sauvages (figure 40a), ce qui nous a permis de valider les conditions expérimentales utilisées. Puis nous avons pu constater que l’absence de Pfa1p n’avait aucun effet visible sur la localisation de Prp43p, toujours nucléolaire (figure 40a). Nous avons aussi contrôlé la localisation de Prp43p dans des cellules vivantes. Pour ce faire, nous avons transformé des souches sauvages ou !pfa1 avec un vecteur dirigeant l’expression de Prp43p étiquetée GFP. La localisation de Prp43p-GFP dans les deux souches est majoritairement nucléolaire. Ces expériences nous ont donc révélé qu’en absence de Pfa1p, Prp43p était toujours nucléolaire, et donc impliquée dans la biogenèse des ribosomes.
Ensuite, nous voulions tester l’effet de l’absence de Pfa1p sur l’association de Prp43p avec les différents pré-ARNr. Avant tout, il était nécessaire de vérifier que l’absence de Pfa1p n’avait pas d’effet sur l’expression ou la stabilité de Prp43p, sans quoi les résultats auraient été ininterprétables. Une fois cette vérification faite nous avons pu continuer notre étude
(figure 40b). Pour cela, nous avons réalisé des IP avec Prp43p-TAP comme appât. Il était
préalablement nécessaire de construire des souches, sauvage et !pfa1, qui exprimaient Prp43p-TAP. Les efficacités d’immunoprécipitation des pré-ARNr provenant de la souche sauvage ou de la souche !pfa1 ont été comparées. Cette expérience nous a permis de montrer que la l’association spécifique de Prp43p-TAP avec les pré-ARNr 27SA2 et 20S résiste à
l’absence de Pfa1p (figure 40c, pistes 4 et 6). On peut néanmoins noter que Prp43p s’associe plus faiblement au 20S en absence de Pfa1p (figure 40c, pistes 4 et 6). Or Pfa1p est plus fortement associée au 20S qu’aux autres pré-ARNr (Lebaron et al., 2005). Ainsi, Pfa1p n’est pas strictement nécessaire à l’association de Prp43p avec le pré-ARNr 20S. Cependant, Pfa1p pourrait renforcer cette liaison.
L’ensemble de ces résultats nous ont permis de conclure que Pfa1p n’était pas requise pour l’association de Prp43p avec les particules pré-ribosomiques. Toutefois, ce partenaire pourrait stabiliser l’interaction de Prp43p avec le pré-ARNr 20S.
Figure 40 : Analyse de l’effet de l’absence de Pfa1p sur l’intégration de
Prp43p dans les particules pré-ribosomiques
A- Des cellules sauvages ou !pfa1sont fixées et perméabilisées afin de réaliser des
expériences d’immunolocalisation. Le noyau de ces cellules est coloré au DAPI, le nucléole est repéré grâce à un anticorps dirigé contre Nop1p et la localisation de Prp43p est détectée avec un "-Prp43p. B- L’accumulation de Prp43p est analysée, dans la souche sauvage (Wt) et dans la souche !pfa1, par western-blot réalisé avec les "-Prp43p. C- Des IP de Prp43p-TAP sont réalisées à partir d’extraits provenant des souches sauvage et !pfa1. Les pré-ARNr retenus spécifiquement avec Prp43p-TAP sont analysés par northern-blot (27S et 20S), et l’efficacité de précipitation est alors indiquée en dessous des pistes en % du total.
B C
Figure 41 : Analyse de l’effet de l’absence de Gno1p sur l’intégration de
Prp43p dans les particules pré-ribosomiques
A-Des cellules sauvages ou !gno1 sont fixées et perméabilisées afin de réaliser des
expériences d’immunolocalisation à fluorescence. Le noyau de ces cellules est coloré au DAPI, le nucléole est repéré grâce à un anticorps dirigé contre Nop1p et la localisation de Prp43p est détectée avec un "-Prp43p. Un contrôle avec l’anticorps secondaire "R-TRITC seulement est réalisé (TRITC). B- L’accumulation de Prp43p est analysée, dans la souche sauvage (Wt) et dans la souche !gno1, par western-blot réalisé avec les "-Prp43p. C- Des IP de Prp43p-TAP sont réalisées à partir d’extraits provenant des souches sauvage et !gno1. Les ARN retenus spécifiquement avec Prp43p-TAP sont analysés par northern-blot (27SA2,
27SB, 25S, 20S et 18S) ou par extension d’amorce (35S) et l’efficacité de précipitation est alors indiquée en dessous des pistes en % du total.
B
A
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2. Gno1p n’est pas requise pour l’association de Prp43p avec les particules pré-ribosomiques
Exactement comme pour Pfa1p, nous voulions savoir si Gno1p était nécessaire à l’intégration de Prp43p aux particules pré-ribosomiques. Dans un premier temps, nous avons voulu examiner l’impact de l’absence de Gno1p sur la localisation de Prp43p. Pour cela, tout comme pour Pfa1p, nous avons réalisé des immunolocalisations à partir des souches sauvage et !gno1. Nous avons utilisé deux anticorps primaires dirigés contre les protéines Nop1p ou Prp43p. La première des observations était que dans la souche sauvage, Prp43p était majoritairement nucléolaire (figure 41a). Puis nous avons constaté que l’absence de Gno1p affectait le nucléole, car le signal de Nop1p était légèrement modifié (figure 41a). De même, le signal correspondant à Prp43p dans le nucléole était modifié. De plus, en absence de Gno1p on observait des signaux dans le nucléoplasme, révélés avec les anticorps anti-Prp43p. Ceci pouvait correspondre à un changement de localisation de Prp43p en absence de Gno1p. Or, nous avons réalisé un contrôle en utilisant seulement l’anticorps secondaire ("R-TRITC) lors des expériences d’immunolocalisation. Nous avons constaté que dans les souches !gno1, cet anticorps générait des signaux non spécifiques dans le nucléoplasme (figure 41a). Nous avons alors pu conclure, que l’absence Gno1p n’avait pas d’effets nets sur la localisation de Prp43p.
Ensuite, nous avons vérifié que l’absence de Gno1p n’avait pas d’effet sur l’expression ou la stabilité de Prp43p (figure 41b). Puis, nous avons testé l’effet de l’absence de Gno1p sur l’association de Prp43p aux pré-ARNr. Tout comme pour Pfa1p, nous avons construit des souches, sauvage et !gno1, exprimant la protéine Prp43p-TAP. Ensuite ces souches ont été utilisées pour des IP. Les efficacités de co-immunoprécipitations des pré- ARNr obtenues à partir des souches sauvages ou !gno1 ont été comparées. L’analyse de ces résultats nous a permis de conclure que Prp43p-TAP restait associée spécifiquement aux pré- ARNr 35S, 27SB et 20S, également aux ARN matures 18S et 25S, en absence de Gno1p
(figure 41c, pistes 4 et 6).
La première partie de cette étude in vivo nous a permis de réfuter l’hypothèse selon laquelle les partenaires Pfa1p et Gno1p permettraient l’intégration de Prp43p aux particules pré-ribosomiques. Néanmoins, ces partenaires sont tous les deux impliqués dans la biogenèse des ribosomes et capables de s’associer directement à Prp43p. Nous avons donc voulu tester l’effet de l’absence de l’un sur l’expression et la fonction de l’autre.
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