1. L’absence de Pfa1p n’a pas d’effets sur Gno1p in vivo
L’absence et la surexpression de Gno1p perturbent assez fortement la biogenèse des ribosomes et la croissance cellulaire (Guglielmi and Werner, 2002; Lin and Blackburn, 2004). Or, l’absence de Pfa1p, dans les mêmes conditions de culture, ne modifie ni la synthèse des ribosomes, ni la croissance cellulaire. Il était donc peu probable que l’absence de Pfa1p ait de grosses répercutions sur l’accumulation de Gno1p. Nous avons quand même souhaité le tester. Pour cela nous avons construit des souches Wt ou !pfa1 permettant l’expression génomique de la protéine Gno1p-TAP. Cette étiquette nous permettait de détecter la présence de Gno1p-TAP dans ces levures. L’intégration de l’étiquette TAP n’a eu aucun impact sur la croissance des levures, ce qui indiquait que Gno1p-TAP était fonctionnelle. Nous avons donc extrait les protéines de ces souches, puis analysé l’accumulation de Gno1p dans ces deux souches par western-blot. La quantité de protéines déposées a été contrôlée par un western- blot en utilisant des anticorps dirigés contre l’actine. Les résultats obtenus nous ont permis de confirmer que l’absence de Pfa1p n’avait aucun effet sur l’accumulation de Gno1p (non montré).
2. L’absence de Gno1p affecte l’accumulation et la fonction de Pfa1p
Après avoir vérifié que l’absence de Pfa1p n’avait aucun effet sur l’accumulation de Gno1p, nous avons souhaité réaliser l’expérience inverse. Ainsi, nous avons construit des souches sauvages ou !gno1 exprimant la forme étiquetée Pfa1p-TAP. Ces souches nous ont permis de contrôler l’accumulation de Pfa1p-TAP en absence de Gno1p par wesrtern-blot. De manière surprenante, les résultats obtenus montrent que l’absence de Gno1p provoque la déstabilisation de Pfa1p (figure 42, pistes 1 et 2). Ensuite, nous avons voulu contrôler si l’effet de l’absence Gno1p sur Pfa1p-TAP était spécifique, ou si on pouvait aussi l’observer pour les autres protéines associées au 20S. Pour cela, de la même manière que pour Pfa1p, nous avons construit des souches sauvages et !gno1 exprimant des formes étiquetées TAP des protéines suivantes : Rio2p, Dim2p, Slx9p, Enp1p, Tsr1p et Ltv1p. Nous avons contrôlé leur accumulation par western-blot. Seule l’accumulation de Pfa1p était réduite en absence de Gno1p (figure 43a). Cependant nous avons pu remarquer que Ltv1p-TAP était sur-accumulée dans la souche !gno1(figure 43a). La signification de ce résultat nous échappe.
Figure 42 : Analyse des effets de l’absence de Gno1p et de Pfa1p sur les
accumulations respectives de Pfa1p et de Gno1p
La souche sauvage (Wt) et la souche !GNO1 sont transformées afin d’exprimer Pfa1p-TAP. Les protéines de ces levures sont extraites et analysées par western-blot en utilisant des anticorps dont les cibles sont indiquées.
75
La surexposition de ce western-blot a permis de révéler qu’une forme modifiée (migrant plus rapidement) de Pfa1p-TAP était détectable en absence de Gno1p (figure 42,
piste 2). Cette forme modifiée de Pfa1p-TAP migre aux alentours de 65kDa et comporte
toujours l’étiquette TAP (15kDa), insérée en position C-terminale. Une partie C-terminale assez importante de Pfa1p-TAP dont le domaine G-patch constitue sans doute cette forme. Nous avons voulu réaliser des expériences d’IP avec cette forme modifiée. Les protéines retenues sur les billes à la fin de l’IP ont été analysées par western-blot. Nous avons pu contrôler que l’IP de la forme modifiée était aussi efficace que celle de la forme sauvage
(figure 43b, pistes 4 et 6). Puis nous avons pu constater que cette forme de Pfa1p n’était plus
capable d’interagir avec Prp43p en comparaison avec la forme sauvage Pfa1p-TAP (figure
43b, pistes 4 et 6). Ensuite, nous avons souhaité comparer l’association de Pfap-TAP et de
Pfa1p-TAP modifiée avec le pré-ARNr 20S. Les ARN issus de l’IP précédente ont été analysés par Northern-blot. En absence de Gno1p, la forme modifiée de Pfa1p-TAP n’est plus capable de s’associer aux particules contenant le 20S (figure 43c, pistes 4 et 6). De la même façon que pour l’accumulation de Pfa1p, nous avons souhaité savoir si l’effet de l’absence de Gno1p était spécifique. Pour cela, nous avons réalisé des IP de ces différentes protéines étiquetées TAP à partir de la souche sauvage et de la souche !gno1. Puis les ARN issus de ces IP ont été analysés par nothern-blot. L’absence de Gno1p n’a aucun effet sur l’association au pré-ARNr 20S des autres composants des particules pré-40S (figure 43c). On peut remarquer que la surexpression de Ltv1p observée en absence de Gno1p est confirmée par les expériences d’IP, dans la mesure où l’on retrouve plus de Ltv1p-TAP associée au pré-ARNr 20S (figure 43c).
L’ensemble de ces résultats nous permettent de conclure que l’absence de Pfa1p n’a aucun effet sur l’accumulation de Gno1p. En revanche, l’absence de Gno1p affecte spécifiquement l’accumulation de Pfa1p, sa nature et sa capacité à s’intégrer aux particules pré-40S.
Durant cette étude, nous avons démontré que les partenaires à G-patch, Gno1p et Pfa1p, de Prp43p n’étaient pas requis pour son intégration aux particules pré-ribosomiques. Nous avons voulu tester leur impact sur l’activité enzymatique de Prp43p.
B
C
Figure 43 : Etude de l’effet de l’absence de Gno1p sur l’accumulation et la
fonction de Pfa1p
A- L’accumulation de plusieurs composants de la particule pré-40S issus de la souche
sauvage (Wt) ou de la souche !gno1est analysée par western-blot en utilisant un anticorps dirigé contre l’étiquette TAP de ces protéines. Le dépôt des protéines est contrôlé avec un western-blot dirigé contre l’actine. B- Les IP de Pfa1p-TAP réalisées à partir de la souche wt ou de la souche !gno1 sont analysées par western-blot. C- Les IP de différents composants de la particule pré-40S dans des conditions sauvages ou en absence de Gno1p sont analysées par northern-blot.
76