1. La sécrétion d’exosomes par des neurones matures est régulée par le
calcium intracellulaire
En 2006, Julien Fauré et al avaient démontré que la dépolarisation des neurones corticaux en développement augmentait la sécrétion exosomale. Les premiers résultats de l’article 1 montrent qu’il en est de même avec des neurones matures. A 15 jours de culture, les neurones ont été incubés
neuronale. Les exosomes sont ensuite purifiés sur gradient continu de sucrose et l’immunodétection en Western blot avec l’anti-Flotilline-1 montre la présence de vésicules flottant à une densité comprise entre 1.09 et 1.15 g/ml, également marquées par Alix, L1 et GluR2/3 (figure 1 de l’article). L’augmentation du signal Flotilline-1 par rapport à un gradient réalisé à partir d’exosomes de neurones incubés 3h en K5 (milieu non dépolarisant contenant 5 mM de KCl) montre que la dépolarisation membranaire augmente bien la sécrétion exosomale par les neurones matures.
Dans le but d’étudier la régulation de l’étape précise de fusion des MVE avec la membrane plasmique, le temps de récolte des exosomes a été réduit à 5 minutes. Durant ce laps de temps, la quantité d’exosomes sécrétés est trop faible pour visualiser ces derniers sur un gradient de sucrose. L’observation en microscopie électronique (ME) des vésicules présentes dans un culot 100 000 g (étape ultime avant le gradient) démontre la présence de vésicules ayant la taille et la forme des exosomes, pouvant être marquées en immunogold avec un anti-L1 et un anti-GluR2 (figure 2D). Nous avons démontré qu’une augmentation du calcium intracellulaire par incubation des neurones avec de la ionomycine (un ionophore du calcium) augmente significativement la sécrétion des exosomes (figure 2A-C). La pré-incubation des neurones pendant 15 minutes avec le BAPTA-AM qui chélate le calcium intracellulaire annule l’augmentation induite par la ionomycine, confirmant que c’est bien une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire qui favorise la fusion des endosomes multivésiculés avec la membrane plasmique (figure 2E, F).
2. L’observation en microscopie électronique de neurones en culture
révèle la présence d’exosomes sécrétés, à proximité de la membrane
plasmique
Des neurones corticaux à 15 jours de culture ont été incubés avec de la ionomycine et observés en microscopie électronique. La figure 3 montre la présence de paquets de vésicules au voisinage proche de la membrane plasmique des dendrites et du soma (figure 3B). Des images similaires ont pu être obtenues sur des neurones à 8 DIV (figure 3A). La forme et la taille des vésicules repérées sont comparables à celles des vésicules culottées à 100 000 g à partir des surnageants de culture (figure 2 D). De plus, la taille et le nombre de ces vésicules apposées à la membrane plasmique sont comparables à celles des vésicules intraluminales (ILV) contenues dans les MVE (figure3 A, B). Dans certains cas, nous avons été en mesure d’observer des MVE semblant fusionner avec la membrane plasmique (figure 3C).
3. La GFP-TTC est sécrétée par voie exosomale
Dans le but de prouver que les exosomes analysés dans ces expériences proviennent bien de compartiments endosomaux neuronaux, nous avons utilisé la partie C-terminale de la chaîne lourde
de la toxine du tétanos (TTC) couplée à la GFP (GFP-TTC). Cette protéine a la capacité de se lier spécifiquement aux neurones et des études ont montré son endocytose et son transport dans les neurones, de façon similaire à la toxine entière (Bordet et al., 2001; Francis et al., 2004). Les neurones ont été pré-incubés une heure avec la GFP-TTC ou la GFP, puis les exosomes récoltés pendant 5 minutes ont été analysés en Western blot avec un anti-GFP. La figure 4 A montre que la TTC est présente dans le culot 100 000 g tandis que la GFP seule ne l’est pas. La quantité de GFP-TTC sécrétée et culottée par ultracentrifugation augmente significativement avec un traitement des neurones avec 2 µM de ionomycine, ce qui renforce nos observations précédentes (figure 4B). Les exosomes récoltés ont ensuite été séparés sur gradient continu de sucrose. Détectée en Western blot grâce à un anti-GFP, la GFP-TTC flotte dans les mêmes fractions que la Flotilline-1 (figure 4C). Ces analyses montrent que la GFP-TTC est sécrétée par les neurones en association avec les exosomes. Des analyses en cryo-microscopie ont confirmé la présence de la GFP-TTC sur les ILV à l’intérieur des endosomes multivésiculés, ainsi que sur des paquets d’exosomes apposés à la membrane plasmique (figure 4 D, E). Ces résultats montrent que les paquets de vésicules observés contre la membrane plasmique dans les cultures proviennent bien de compartiments endosomaux neuronaux. Ils sont également la première démonstration qu’une protéine connue pour se propager dans le système nerveux entre les neurones par voie trans-synaptique est associée aux exosomes.
4. La sécrétion d’exosomes est régulée par l’activité glutamatergique
Les neurones corticaux ont été incubés avec la bicuculline, un inhibiteur des récepteurs GABAergiques, afin d’augmenter l’activité des synapses glutamatergiques. Comme montré sur la figure 5 (A et B), une augmentation drastique de la sécrétion exosomale est observable après 10 minutes d’incubation avec la bicuculline. L’addition de CNQX, antagoniste des récepteurs AMPA, ou de MK801, qui inhibe les récepteurs NMDA, réduit significativement la sécrétion exosomale en présence de bicuculline. Ces résultats montrent qu’il existe une régulation de la sécrétion exosomale par les récepteurs AMPA et NMDA synaptiques. L’incubation des neurones corticaux avec la picrotoxine, un autre inhibiteur des récepteurs GABAergiques a un effet similaire à celui de la bicuculline (figure 5C). L’ensemble de ces observations montre que la sécrétion des exosomes par des neurones en culture est régulée par l’activité synaptique glutamatergique.