II. La toxine du tétanos
1. Les exosomes GFP-TTC se fixent et sont internalisés par les neurones
Les exosomes portant la GFP-TTC sont incubés à 37°C sur des lamelles portant des neurones d’hippocampe placées en chambre humide. Au bout d’une heure d’incubation, un marquage GFP très ponctué est visible presque exclusivement sur les neurites et le corps cellulaire des neurones. Comme pour les exosomes GFP-CD63 de N2a, la taille relativement importante des points laisse penser qu’il s’agit de paquets d’exosomes véhiculant la GFP-TTC (Figure 42).
Pour déterminer la localisation subcellulaire des exosomes GFP-TTC, les neurones receveurs ont été préalablement transfectés avec le plasmide codant pour la protéine fluorescente mCherry et observés au microscope confocal. Les nombreux points GFP observés correspondent certainement à des agrégats d’exosomes qui se sont fixés et/ou qui ont été endocytés par les neurones receveurs. Les neurites de ces derniers sont décorées par les exosomes GFP-TTC qui paraissent fixés à intervalle régulier le long de ces prolongements cellulaires. Une fois internalisés, les exosomes sont retrouvés majoritairement au niveau du soma (Figure 43).
Figure 42 Les exosomes véhiculant la GFP-TTC se fixent aux neurones en culture. Des neurones d’hippocampe âgés de 9DIV ont été incubés 1h avec des exosomes sécrétés par des neurones corticaux préalablement incubés avec de la GFP-TTC. Les exosomes GFP-TTC ont été purifiés sur gradient continu de sucrose. Microscopie à fluorescence, 100X ; en haut à gauche, cellules observées en contraste de phase ; à droite, exosomes GFP-TTC, en bas, superposition des deux images. Bar : 10 µm.
Figure 43Les exosomes GFP-TTC se fixent et sont internalisés par les neurones receveurs. Des exosomes sécrétés par des
neurones corticaux préalablement incubés avec de la GFP-TTC ont été purifiés sur gradient continu de sucrose et incubés pendant 1h sur des neurones d’hippocampe (16DIV) transfectés mCherry. Microscopie confocale, sommation de trois plans choisis au cœur du neurone (substack maker, Image J).
Dans la Figure 44, les neurones ont été mis en présence de WGA-Alexa Fluor 594 pendant 10 min à 37°C puis lavés et incubés 1h avec des exosomes véhiculant la GFP-TTC. Cette étape de coloration préalable permet une internalisation progressive du WGA. Observés dans un plan donné, certains amas d’exosomes GFP-TTC forment des points verts à la surface du neurone, d’autres apparaissent jaunes lorsqu’ils se superposent au WGA rouge membranaire (Figure 44A, flèches). Il est également possible d’observer des structures cytoplasmiques marquées au WGA contenant de la fluorescence GFP et ce, surtout au niveau du corps cellulaire (Figure 44A, encadré). La projection des maxima permet de rendre compte de la spécificité de fixation et d’endocytose de tous les exosomes GFP-TTC sur les neurones en présence (Figure 44B).
Figure 44Fixation et internalisation d’exosomes GFP-TTC sur des neurones préalablement colorés au WGA. Des neurones
corticaux ont été incubés avec de la GFP-TTC et leurs exosomes purifiés sur gradient de sucrose. L’incubation des exosomes GFP-TTC a été précédée d’une coloration au WGA 10 min à 37°C pour permettre au colorant d’être internalisé. A) observation au microscope confocal dans un plan donné d’un corps cellulaire neuronal présentant à la fois des paquets d’exosomes fixés (flèches) et internalisés (encadré) ; B) vue d’ensemble avec projection des maxima. Bar : 10 µm.
Les observations au microscope confocal couplé à différentes techniques de visualisation des neurones receveurs nous ont donc permis d’apporter la preuve que des exosomes neuronaux véhiculant la GFP-TTC peuvent se fixer et être internalisés par des neurones d’hippocampe naïfs. Cependant, lorsque l’on analyse la position des exosomes GFP-TTC sur les neurones incubés, il est parfois difficile de conclure quant à leur internalisation ou non. Pour y remédier, nous avons tenté de mettre au point un protocole d’incubation d’exosomes suivie de bains acides pour débarrasser les neurones receveurs des exosomes uniquement fixés (non endocytés) mais cette technique délicate provoquait une mort neuronale massive et a dû être abandonnée. Toujours dans l’idée de se focaliser sur les exosomes internalisés, nous avons alors travaillé avec de la TTC couplée à la HRP (Horseradish Peroxydase). La protéine HRP-TTC est obtenue par couplage in vitro de la TTC à la peroxydase du raifort (HRP). Tout comme la GFP-TTC, qui, elle, est une protéine de fusion, la TTC-HRP est capable de se fixer aux neurones et d’être internalisée. Des neurones corticaux ont été incubés avec de la TTC-HRP puis leurs exosomes ont été purifiés sur gradient de sucrose et incubés pendant 1h sur des neurones hippocampiques. Pour visualiser la HRP-TTC transportée via les exosomes, on utilise l’activité enzymatique oxydative de la HRP pour précipiter un chromogène, le DAB (3,3’-diaminiobenzidine tétrahydrochloride). En présence d’acide ascorbique, ce dernier est préférentiellement oxydé par rapport au DAB. En revanche, l’acide ascorbique ne passe pas les membranes cellulaires donc il entre en compétition avec le DAB uniquement à l’extérieur des neurones. Seul le DAB interne est précipité (couleur sombre) : seuls les exosomes HRP-TTC internalisés sont visualisés (Figure 45, flèches). En permettant de ne visualiser que les exosomes internalisés, cette expérience confirme les observations des expériences précédentes qui montrent une localisation préférentiellement somatique des exosomes endocytés.
Figure 45Visualisation des exosomes véhiculant la TTC couplée à la HRP qui ont été internalisés par les neurones. Des
neurones corticaux ont été incubés 1h avec de la TTC couplée à la HRP (peroxydase du raifort), leurs surnageants ont été récupérés et leurs exosomes concentrés sur gradient continu de sucrose. Des neurones hippocampiques (16 DIV) ont été incubés 1h avec les exosomes transportant la TTC-HRP. La révélation de l’activité de la peroxydase s’est faite en présence d’acide ascorbique, substrat compétitif du DAB mais qui est incapable de traverser les membranes cellulaires. Les grains noirs observés (flèches) correspondent à du DAB précipité par de la HRP associée aux exosomes qui ont été internalisés.