III. ARN exosomaux
2. Analyse du contenu en ARN des exosomes neuronaux
Nous avons vérifié que les exosomes neuronaux contenaient également des ARN (coll. Joël Lachuer, C. Rey) en dressant le profil Agilent d’un culot 100 000 g d’exosomes sécrétés par des neurones corticaux dont les surnageants avaient été préalablement traités à la RNase (Figure 51). D’autres microvésicules contenant de l’ARN protégé peuvent potentiellement être culottées à 100 000 g en même temps que les exosomes. Pour séparer les vésicules en présence, nous avons déposé le culot 100 000 g sur un gradient continu de sucrose. 10% de chaque fraction ont été analysés en Western blot afin de repérer les protéines Alix et Flotilline-1 et donc les exosomes qui les contiennent. Les ARN contenus dans les 90% restant ont été analysés grâce au Bioanalyzer Agilent 2100 (Figure 52). La Figure 52 montre les profils obtenus pour l’ensemble du gradient et le Western blot qui lui est associé. Le Western blot révèle la fraction 5 comme positive pour Alix et Flotilline-1, démontrant la présence d’exosomes dans cette fraction. Il est à noter que le dépôt de seulement 1/10e des fractions sur le gel de Western blot ne permet de détecter que le pic d’exosomes, il est probable que des exosomes se trouvent également dans les fractions alentours, c’est-à-dire les fractions 4 et 6 mais en moindre quantité. Dans les profils Agilent, on peut voir que les premières fractions du gradient sont vides de tout ARN. Par contre, un pic d’ARN courts est bien visible dans les fractions 4 et 5 (Figure 52, encadré). Ensuite, le profil du signal décroît et disparaît dans les fractions suivantes, dénotant une absence d’ARN dans ces fractions. La torsion de la ligne de base observée en fond de gradient serait due à l’absence de matériel génétique et à la présence de résidus de phénol.
Figure 51 Les exosomes sécrétés par les neurones corticaux en culture contiennent majoritairement des microARN. Les
ARN totaux contenus dans les neurones corticaux (Cx) et leurs exosomes (culot 100 000 g) ont été isolés à l’aide des kits Qiagen miRNeasy Mini Kit et RNeasy Micro Kit (protocole C. Rey) et analysés sur picopuce Bioanalyser Agilent 2100, les surnageants ont été préalablement traités à la RNase. A) graphe obtenu avec un échantillon-échelle permettant d’établir la correspondance entre la taille des ARN (nucléotides, nt) et la valeur en abscisse donnée en secondes (s) ; B) profil des ARN cellulaires, on dénote la présence des ARN ribosomiques 18 S et 28 S ; C) Les exosomes de neurones corticaux (Cx) contiennent des ARN de taille ≤25 nt, il s’agit très probablement de microARN.
Figure 52 Les petits ARN repérés dans le culot 100 000 g sont bien contenus dans des exosomes. Les surnageants de
neurones corticaux stimulés en K25 ont été récupérés, traités à la RNase et le culot 100 000 g a été déposé sur un gradient continu de sucrose. Les lysats, l’input (=5% du culot 100 000 g) et 1/10e des fractions ont été analysés en Western blot. Les exosomes, repérés avec un anti-Alix et un anti-Flotilline-1 se concentrent dans la fraction 5. Les ARN cellulaires et les ARN contenus dans chaque fraction ont été isolés (Qiagen, protocole C. Rey) et leur profil Agilent, dressé (Picopuce). Les petits ARN sont sécrétés en association avec les exosomes (fractions centrales encadrées).
Dans cette expérience réalisée sur des neurones stimulés en K25, les petits ARN sont détectés dans les fractions du gradient où se trouvent les exosomes. Ils ont été protégés de l’action de la RNase par la membrane des exosomes qui les contenaient. Nous avons aussi réalisé cette observation sur des neurones stimulés à la bicuculline (Figure 53). Là encore, les petits ARN trouvés dans un culot 100 000 g sont contenus dans les exosomes sécrétés par les neurones et séparés sur gradient continu de sucrose. Ceci est particulièrement visible dans la Figure 53A où le signal observé pour la fraction 5 se confond totalement avec celui observé pour le culot 100 000 g (input: 5% du culot). A contrario, il domine nettement les profils des fractions 6 et 9 (Figure 53B).
Figure 53 Profil Agilent des exosomes neuronaux stimulés à la bicuculline. Des neurones corticaux (15 DIV) ont été
stimulés 15 minutes avec 40 µM de bicuculline. Les surnageants ont été récoltés, traités à la RNase et le culot 100 000 g déposé sur un gradient continu de sucrose. Les ARN cellulaires, les ARN présents dans l’input (5% du culot 100 000 g) et les ARN contenus dans chaque fraction ont été isolés (Qiagen, protocole C. Rey) et leur profil Agilent, dressé (Picopuce). A) comparaison des profils obtenus pour les lysats cellulaires (en vert), la fraction 5 (exosomale, en bleu) et l’input (en rouge). Les courbes bleue et rouge se superposent parfaitement ; B) comparaison des profils de la fraction 5 (exosomes, en rouge), de la fraction 6 (en bleu) et de la fraction 9 (fond du gradient, en vert). Les ARN se concentrent dans la fraction exosomale.
D’après nos observations, les exosomes de neurones corticaux contiennent majoritairement des ARN courts dont probablement des microARN. En nous basant sur l’étude transcriptomique faite sur les exosomes de N2a (plaques TLDA cf. Figure 50), nous nous sommes concentrés sur deux microARN détectés dans ces exosomes : le miR132 et le miR138. Ces deux microARN jouent des rôles clés dans des aspects de développement et de plasticité neuronale et leur dysfonctionnement conduit à l’apparition de pathologies (Im and Kenny, 2012). Nous nous sommes demandé si ces deux miR étaient présents dans les exosomes de neurones corticaux. En collaboration avec Hélène Ipas, doctorante sur la plateforme transcriptomique de l’institut (Equipe Nanosciences et Cerveau), nous avons réalisé des RT-q-PCR sur des lysats et des exosomes de N2a en parallèle de lysats de neurones corticaux et de leurs exosomes (Figure 54). Après extraction des ARN courts (à l’aide du kit miRNeasy mini, en suivant l’appendix ‘ARN courts’), les profils de nos différents échantillons ont été analysés sur puce Agilent. Dans nos quatre éluats, nous avons confirmé la présence d’ARN dont la taille est inférieure ou égale à 200 nt (Figure 54A).
Une fois nos échantillons validés, nous avons procédé à des réactions de transcription inverse ou RT (Reverse Transcription) avec des amorces spécifiques pour les microARN matures miR132 et miR138 respectivement. Enfin, les produits des RT ont subi une amplification en q-PCR (quantitative PCR). Alors que la PCR est une technique qualitative de détection de la présence, après amplification, de l’ADN complémentaire (ADNc) du miR d’intérêt, la q-PCR est utilisée pour mesurer quantitativement l'amplification de cet ADNc grâce à des sondes fluorescentes. Lors de la q-PCR, la formation de chaque nouvel amplicon est détectée par l'accumulation d'un signal fluorescent. Le Ct (cycle threshold) est défini comme le nombre de cycles d’amplification nécessaire pour atteindre une valeur-seuil du signal fluorescent (threshold) définie au-delà de tout bruit de fond (Figure 54B). Le nombre de Ct est corrélé négativement à la quantité de l’ADN cible présent dans l'échantillon. Ainsi, pour les lysats de N2a, le Ct pour le miR132 est bien plus élevé que le Ct du miR138. Cela signifie que ces lysats cellulaires sont très enrichis en miR138 par rapport au miR132. On constate le même profil d’enrichissement dans leurs exosomes. Quant aux lysats de neurones corticaux, ils sont relativement enrichis en miR138 par rapport au miR132. A contrario, leurs exosomes contiennent plus de miR132 que de miR138 (Figure 54). Cette différence d’enrichissement démontre la sélection des miR exosomaux.
En purifiant les vésicules culottées à 100 000 g sur un gradient continu de sucrose, nous avons démontré que les petits ARN détectés étaient strictement contenus dans les exosomes. Les exosomes neuronaux contiennent majoritairement des ARN courts, parmi lesquels les miR138 et 132, identifiés en RT-q-PCR.
Figure 54Les exosomes neuronaux contiennent les miR 132 et 138. Des neurones corticaux (15 DIV) ont été stimulés 15
minutes avec 40 µM de bicuculline, les surnageants ont été récoltés, traités à la RNase et culottés à 100 000 g (Exos Cx). Des N2a ont été lavées 2 fois en PBS, placées dans du milieu « exosome-free » pendant 24h. Leurs surnageants ont été récoltés, traités à la RNase et culottés à 100 000 g (Exos N2a). Les ARN courts (≤200 nt) ont été isolés à partir des lysats de neurones corticaux (Lysats Cx), de N2a (Lysats N2a) et de leurs exosomes respectifs à l’aide du kit miRNeasy mini, appendix ‘ARN courts’ de Qiagen. A) vérification des profils Agilent des ARN isolés à partir des lysats cellulaires (neurones corticaux et N2a) et de leurs exosomes respectifs (culot 100 000 g) (Picopuce Bioanalyser Agilent 2100) ; B) les miR 132 et 138 sont sélectivement enrichis dans les exosomes neuronaux et de N2a. RT-q-PCR des quatre échantillons avec des amorces spécifiques pour le miR132 et pour le miR138 respectivement (Taqman, life technologies).