Les exosomes portant la GFP-TTC présentent une spécificité de fixation

A un stade de culture avancé, les neurones hippocampiques âgés de plus de 14 DIV ont développé un réseau neuritique très dense. Nos observations précédentes nous ont permis de constater que les exosomes se fixent préférentiellement aux cellules et n’adhèrent pas au substrat de culture. Lorsque l’on examine les enchevêtrements de neurites colorées au WGA rouge, on constate que tous les neurones ne sont pas marqués de points verts (Figure 46A).

En multipliant les observations, il nous est apparu que les exosomes transportant la GFP-TTC ne se fixent pas à tous les neurones présents sur la lamelle incubée. Nous avions fait le même constat lors de l’incubation de GFP-TTC seule à plus faible concentration que celle utilisée pour obtenir des exosomes GFP-TTC. A l’issue d’une incubation avec des protéines de fusion GFP-TTC à la concentration de 288 pM (au lieu de 36 nM), tous les neurones ne présentent pas de marquage GFP (données non montrées). Il semblerait donc que les exosomes portant la GFP-TTC présentent une spécificité de fixation interneuronale comparable à celle observée lorsque l’on incube la GFP-TTC seule sur des neurones naïfs.

L’emploi d’AraC limite la prolifération des cellules gliales dans nos cultures de neurones primaires. Sur des lamelles non traitées à l’AraC, les cellules gliales sont nombreuses et forment un substrat de choix pour la pousse neuritique des neurones. L’incubation d’exosomes GFP-TTC sur de telles lamelles montre la fixation et l’internalisation préférentielle sur les neurones. Une coloration au WGA-Alexa Fluor 594 à 4°C pendant 2 minutes (pour empêcher une internalisation de ce colorant et ne marquer que les membranes plasmiques) permet de repérer les cellules gliales aplaties sur le substrat de culture et montre bien que les exosomes ne se fixent pas à ces cellules. (Figure 46B). Une immunofluorescence avec un anticorps dirigé contre la GFAP nous a permis de constater que les exosomes véhiculant la GFP-TTC ne se fixent pas aux astrocytes. (Figure 47). Bordet et al avaient utilisé le même type d’immunomarquage pour démontrer la très forte affinité et spécificité de l’extrémité C-terminale de la chaîne lourde de la TeNT pour les neurones (Bordet et al., 2001).

Figure 46 Les exosomes transportant la GFP-TTC ne se fixent pas à toutes les cellules présentes dans la culture. Des

exosomes sécrétés par des neurones corticaux préalablement incubés avec de la GFP-TTC ont été purifiés sur gradient continu de sucrose et incubés pendant 1h sur des neurones d’hippocampe (16DIV). Les membranes cellulaires ont été colorées avec du WGA-Alexa fluor 594 (2 min, à 4°C). A) les exosomes GFP-TTC ne se fixent pas à tous les neurones. Certaines neurites sont décorées par de nombreux points verts, d’autres pas du tout ; B) les exosomes GFP-TTC ne se fixent pas aux cellules gliales. Dans une culture non traitée à l’Ara-C, des cellules gliales tapissent le substrat de culture. Alors que les neurones environnants présentent des paquets d’exosomes fixés sur leurs neurites, les cellules gliales apparaissent dépourvues de marquage GFP.

Figure 47 Les exosomes GFP-TTC ne se fixent pas aux astrocytes. Des neurones corticaux ont été incubés 1h avec de la

GFP-TTC, leurs exosomes ont été récupérés et séparés sur gradient continu de sucrose. Les exosomes véhiculant la GFP-TTC ont été incubés 1h sur une culture de neurones d’hippocampe (22DIV). Les astrocytes présents dans la culture ont été repérés en immunofluorescence avec un anticorps dirigé contre la GFAP (en rouge). Microscopie confocale, image dans un plan donné.

Il semblerait donc que le devenir des exosomes neuronaux puisse être influencé par le cargo qu’ils portent à leur surface. Ainsi les exosomes transportant la GFP-TTC présentent une spécificité de fixation intercellulaire. Comme la toxine du tétanos dont la GFP-TTC reproduit le comportement, les exosomes GFP-TTC ne se fixent pas à tous les neurones en culture et surtout ils n’ont aucune affinité pour les cellules gliales. Nous nous sommes alors demandé si les exosomes portant la GFP-TTC se fixaient préférentiellement aux extrémités pré-synaptiques comme cela est le cas pour la toxine entière.

3. Les exosomes portant la GFP-TTC présentent une spécificité de

fixation subcellulaire

En accord avec la littérature (Matteoli et al., 1996), nous avons montré plus haut que la GFP-TTC se fixe au niveau des parties pré-synaptiques des neurones hippocampiques et corticaux (cf. Article 1, données supplémentaires). Des immunomarquages sur des neurones ayant été incubés avec des exosomes GFP-TTC, montrent que le signal GFP colocalise souvent, mais pas exclusivement, avec celui de la synaptophysine (Figure 48A). Dans le cas de PSD95, on observe souvent une juxtaposition mais jamais de superposition du marquage PSD95 avec les exosomes GFP-TTC (Figure 48B). Ces observations montrent donc que les exosomes porteurs de l’extrémité C-terminale de la chaîne lourde de la TeNT se fixent de façon préférentielle aux extrémités pré-synaptiques des neurones naïfs. Cette fixation subcellulaire caractéristique de la GFP-TTC laisse penser que la voie d’entrée des exosomes neuronaux peut être modifiée par une protéine pathogène portée à leur surface telle que la TeNT.

Les exosomes véhiculant la TTC ne se comportent pas comme les exosomes de N2a GFP-CD63. Nous avons en effet constaté que ces derniers peuvent se fixer et être internalisés par des cellules gliales présentes dans la culture (cf. Figure 38). De surcroît, lorsque des exosomes GFP-CD63 se fixent aux neurones, nous n’avons pas remarqué de colocalisations entre le signal GFP de ces vésicules et les extrémités pré-synaptiques marquées grâce à une immunofluorescence dirigée contre la synaptophysine (cf. Figure 37).

Les modes de fixation des exosomes GFP-CD63 et des exosomes GFP-TTC diffèrent donc sur plusieurs points. Les exosomes portant la GFP-TTC semblant réellement reproduire le comportement de la toxine seule, nos expériences suggèrent donc que la fixation des exosomes est influencée par leurs cargos. Il nous faudrait maintenant comparer le comportement de ces exosomes neuronaux à d’autres exosomes fluorescents sécrétés par des neurones et non par des N2a.

Figure 48 Les exosomes véhiculant la GFP-TTC se fixent préférentiellement aux extrémités pré-synaptiques. Des

exosomes contenant la GFP-TTC ont été incubés 1h sur des neurones d’hippocampe à 22 DIV. Les cellules ont ensuite été lavées, fixées et soumises à une immunofluorescence. A) les exosomes GFP-TTC colocalisent majoritairement avec la synaptophysine (IF, en rouge) ; B) les exosomes GFP-TTC ne se fixent pas aux extrémités post-synaptiques repérées avec un anti-PSD95 (IF, en rouge). Microscopie confocale, sommation de trois plans choisis au cœur du neurone (substack maker, Image J).