Résistance aux facteurs externes extrêmes

Dans la forme dormante de la spore bactérienne, les processus métaboliques sont inactivés engendrant une grande résistance de la cellule aux facteurs externes tels que la chaleur humide, les radiations, la dessiccation ainsi que les agents oxydants. Cette forme particulière de survie confère aux spores une grande longévité et une forte capacité d’adaptation pratiquement à tous les environnements. Un nombre important d’études s’intéressant à la résistance des spores de Bacillus et Clostridium ont permis d’identifier plusieurs facteurs influant sur leur niveau de sensibilité. Ces facteurs peuvent être : la constitution génétique, les conditions de sporulation, l’imperméabilité réduite des spores, leur faible teneur en eau, la quantité de minéraux à l’intérieur du cortex, la saturation de

l’ADN avec des protéines SASP et la capacité de réparation des molécules pendant la germination [20]. Dans une étude synthétique Nicholson et al [20] discutent le rôle de ces facteurs dans la résistance aux différents types d’agents biocides (tableau (5.2)).

Effet sur les facteurs de résistance

Protéines Eau Minéraux Réparation Les

Traitement SASP dans le dans de l’ADN tuniques Sporulation type α/β lcortex le cortex

Dessiccation ++ - ? +/- ? ? Chaleur sèche ++ - +/- + ? ? Chaleur humide + ++ + - +/- + Radiations-γ - ++ ? ++ ? ? Radiations UV ++ - ? ++ - - Les alkylants ++ ? ? ++ - ? Formaldéhyde ++ ? ? ++ - ? Glutaraldéhyde - ? ? - ++ +/- Lode - ? ? - ++ +/- Peroxydes ++ ++ ? - + ?

Tableau 5.2 – Le rôle des facteurs de résistance des spores de Bacillus à de différents agents biocides (modifié d’après Nicholson et al [20])

5.4.1.3.1 Résistance à la chaleur : une des principales caractéristiques des spores est leur résistance à des températures extrêmes. Ainsi, la valeur de D (le temps nécessaire pour réduire la viabilité par un facteur de 10) est de 20–30 minutes pour une exposition à une température de 100°C (chaleur humide) et leur résistance est encore plus grande quand elles sont exposées à la chaleur sèche (voir figure (5.12)).

Les mécanismes biocides des deux types de chaleur sont différents. En effet, la cible de la chaleur humide semble être les protéines de choc thermique qui jouent un rôle essentiel dans leur résistance à la chaleur humide. Dans le cas de la chaleur sèche, l’inactivation des spores se fait en grande partie par des lésions de l’ADN, principalement par dépurination [176]. En même temps les protéines SASP confèrent une grande résistance à la chaleur. Ainsi, Setlow et al. [176] ont montré que les spores mutantes α−/β− (caractérisées par l’abscence des protéines SASP α/β) ont un taux de survie de seulement 0,03% après 15 minutes d’exposition à 90°C, alors que le taux de survie de la souche sauvage après 60 minutes à 90°C est de 90%.

Figure 5.12 – Valeurs de D obtenues pour des spores de Bacillus subtilis exposées à la chaleur sèche et à la chaleur humide [20]

5.4.1.3.2 Résistance aux UV : les spores deB. subtilis sont 5 à 50 fois plus résis- tantes aux UV que les cellules végétatives [177]. Cette résistance élevée aux rayonnements UV des spores est due à deux facteurs essentiels [178] :

- La photochimie de l’ADN : contrairement à sa bactérie végétative, la spore de la famille des bacilles exposée aux UV ne génère que peu, ou pas du tout, de dimère de cyclobutane, procureur des inhibiteurs de l’ADN, mais plutôt un photo-produit de spores (PS) connu sous la forme 5-(α-thyminyl)-5,6-dihydrothymineo.

- La réparation de l’ADN : qui se fait à l’aide des photo-produits spécifiques aux spores, fabriqués pendant le processus de sporulation. Ces PS spécifiques sont responsables de la synthèse d’enzymes de réparation très efficaces qui augmentent la résistance de la spore aux UV.

L’influence du rayonnement UV sur la survie bactérienne de la spore B. subtilis (ATCC6633) est largement étudiée dans la littérature [179, 180]. Hoyer [181] a définit les conditions standards permettant la mesure de la dose nécessaire à la désinfection de l’eau par un rayonnement monochromatique à 254 nm. L’auteur compare la survie bactérienne d’E. coli à celle des spores de B. subtilis (ATCC6633) à différentes doses de rayonnement. Dans ses résultats, il montre qu’une réduction de 7 log₁₀ est obtenue sur les E. coli traitées à des doses inférieures à 100 J/m2 , tandis que de telles doses ne produisent aucun effet sur les spores de B. subtilis. Selon ses mesures une dose de 400 J/m2_{(limite supérieure du standard européen) ne produirait que 2 log}

10de réduction

Figure 5.13 – Survie bactérienne de B. sublilis ATCC 6633 en fonction de la dose du rayonnement UV à 254 nm.

de la spore de B. subtilis (ATCC6633) aux rayonnements UV a fait l’objet de plusieurs études. Sur le tableau (5.3) sont montrés quelques exemples de la valeur de la dose UV nécessaire à l’obtention de 1 log10 de réduction de la population initiale (D-value)

λ (nm) D-value (min) Milieu de culture / direction des UV Réf

120 Eau / multidirectionnel [181]

254 130 PBS / parallèles [179]

67 20 ml d’eau désionisée/ parallèle [180]

293 33

290 68

265 64

240 165 20 ml d’eau désionisée/ parallèle [180]

230 80

214 63

Tableau 5.3 – Valeurs de D (D-value) correspondant à la souche B. subtilis (ATCC 6633) obtenue selon le milieu de culture et le mode d’exposition aux UV.

Les valeurs de D montrent que la résistance de la souche B. subtilis (ATCC6633) dépend énormément des conditions de traitement, notamment du milieu d’inoculation et de la façon dont les spores sont exposées aux rayonnements UV. En effet, Hadas et al. [180] ont rapporté que le volume de la suspension et la surface du support (boite de Pétri) influent de manière considérable les résultats des tests. Hoyer [181] démontre également que la distance de la source UV par rapport à l’échantillon présente de fortes incidences sur les résultats de la décontamination.

5.4.1.3.3 Resistance aux agents chimiques : Comme dans le cas des autres agents biocides, les spores sont plus résistantes que les cellules végétatives à l’attaque de

substances chimiques, tels que les acides, les bases, les aldéhydes, les agents alkylants et les agents oxydants. Les caractéristiques de spores qui leurs confèrent cette résistance ne sont pas entièrement comprises. Toutefois, les cibles de ces agents ne sont pas toujours les mêmes. Ainsi plusieurs études ont montré que les agents oxydants inactivent les spores probablement en affectant leurs structures externes, principalement leur membrane interne [182]. La membrane dégradée ne va pas permettre la survie de la cellule après sa germination. En même temps certaines substances chimiques tel que les agents alkylants ont comme cible l’ADN.

Les facteurs impliqués dans la résistance à une partie de ces substances chimiques sont les tuniques, l’imperméabilité des spores, le contenu réduit en eau et la protection de l’ADN. Les tuniques de nature protéique jouent un rôle primordial dans la résidence contre les attaques chimiques. Elles forment une barrière qui protège le cortex de la spore. Cette barrière est efficace contre les agents oxydants, mais elle n’affecte pas la capacité biocide des agents alkylants. La résistance donnée par la tunique externe ne semble pas être liée à une protéine spécifique, mais elle fonctionne plutôt comme un bouclier qui détoxifie les produits chimiques les empêchant d’affecter le cortex [182]. Ainsi, même si au niveau de l’exosporium la présence de la superoxyde dismutase a été mise en évidence, son rôle dans résistance aux agents chimiques n’a pas été démontré.

L’imperméabilité des spores est assurée par la membrane interne. Cortezzo et Setlow [183] ont modulé la perméabilité des spores de Bacillus subtilis en variant la température de sporulation et ils ont montré que les spores les plus perméables sont moins résistantes aux produits chimiques génotoxiques qui doivent arriver au niveau du cortex pour affecter les spores.

La protection de l’ADN par des protéines SASP n’affecte pas seulement la capacité des spores à résister à l’action de facteurs physiques (chaleur, UV) mais aussi celle de limiter les effets biocides des agents chimiques. La comparaison des taux de survie de spores de Bacillus subtilis sauvages et de spores mutantes α− β− a mit en évidence le rôle protectif de SASP contre les effets du peroxyde d’hydrogène, du formaldéhyde et de l’acide nitrique [182].

5.4.2 Influence de la morphologie de surface sur l’efficacité biocide du