Matériels et méthodes

5.2.1 Analyses microbiologiques

5.2.1.1 Evaluation de la survie de la flore aérobie totale du poivre

Dans cette étude nous avons utilisé une suspension de spores de Bacillus subtilis (ATCC 6633) contenant environ 108 CF U/ ml ainsi que deux types de supports : des grains de poivre et des coupons de verre. Avant inoculation, les supports ont été stérilisés par chaleur sèche à 180°C pendant 2 heures. Les échantillons stériles ont été ensuite inoculés, soit avec environ 106 CF U/g pour les grains de poivre, soit 10 µl de suspension pour les coupons de verre, avant d’être séchés à température ambiante pendant 24 heures. Après les avoir exposé au plasma, les spores ont été récupérées dans 10 ml de tampon phosphate contentant 0,1% Tween 80%. Les dilutions en série ont été inoculées sur des plaques de géloses trypto-caseine soja (TSA, Difco) et incubées à 30°C pendant 24 à 48 h avant le dénombrement des colonies. La figure (5.1) synthétise les différentes étapes de l’analyse microbiologique.

5.2.1.2 Evaluation du rôle des UV dans l’inactivation des endospores Pour séparer l’effet des rayonnements ultraviolets de celui des espèces réactives du plasma, des spores de B. subtilis ont été inoculées sur des coupons en verre et traitées par plasma en interposant un filtre optique entre la source plasma et l’échantillon. Ce filtre (WG42012, Thorlabs) permet de faire barrière aux espèces réactives tout en laissant passer les rayonnements UV. La transmission du filtre ainsi que le spectre d’absorbance de l’ADN dans l’UVC sont représentées sur la figure (5.2). Après exposition au plasma, les spores ont été récupérées dans 10 ml de tampon phosphate contentant 0,1% Tween 80%. Les dilutions en série ont été inoculées sur des plaques de gélose trypto-caseine soja (TSA, Difco) et incubées à 30°C pendant 24 à 48 h avant le dénombrement des colonies. Leur survie a été ensuite comparée avec celle des spores traitées en absence du filtre.

Figure 5.2 – Transmission du filtre Thorlabs WG42012 et le spectre d’absorbance de l’ADN dans l’UVC.

5.2.1.3 Analyse de la morphologie des spores par microscopie électronique

Afin de mettre en évidence les effets du plasma sur la morphologie des spores deB. subtilis, des coupons en verre ont été examinés par microscopie électronique à balayage (MEB). Les analyses au MEB ont été réalisées au Centre de Microscopie Electronique Appliquée à la Biologie (CMEAB) de l’Université Toulouse 3, Paul Sabatier.

Pour cette étude, les échantillons ont été préparés de la même manière que pour l’étude de la survie décrite précédemment (voir figure (5.1)). Afin d’améliorer le contraste des images observées, les échantillons ont été fixés sur des plots métalliques et ont été recouverts d’une couche de platine d’environ 10 nm en utilisant un système de dépôt de couches minces par plasma (Leica EM MED020, Leica Microsystems). Les échantillons ont été

observés par microscopie électronique à balayage (Quanta 250 FEG FEI, Thermo Fisher Scientific) à 15 kV.

5.2.2 Analyse des propriétés physico-chimiques

Pour d’évaluer l’effet du plasma sur les propriétés physico-chimiques du poivre noir traité, nous avons mesuré les changements occasionnés par les traitements sur cinq paramètres : l’humidité, la couleur du poivre, l’absorbance à 420 nm, le pH et le contenu en pipérine.

5.2.2.1 Mesure de l’humidité

Les mesures de l’humidité du poivre ont été effectuées à l’aide d’un humidimètre (MB25, Ohaus). Dans toutes les mesures effectuées dans ce travail, des échantillons de 3 g de poudre de poivre ont été utilisés. Les échantillons ont été chauffés à 85°C jusqu’à la stabilisation du poids et le pourcentage d’humidité a été enregistré.

5.2.2.2 Mesure de l’absorbance à 420 nm

Le but des mesures d’absorbance effectuées dans ce travail est d’évaluer l’effet du plasma sur la concentration en pigment du poivre noir traité. En effet, le poivre noir contient plusieurs types de pigments (dont la plus abondante est la chlorophylle a). L’ensemble de ces pigments absorbent le rayonnement du spectre visible et présentent plusieurs pics d’absorption : un groupe de pics de fortes intensités se situe entre 400 et 500 nm, et un autre de plus faibles intensités, est présent entre 600 et 700 nm.

La somme de cinq profils d’absorption dans le visible, correspondant à cinq types de pigments différents (dont la chlorophylle a), a été calculée par Thrane et al. [15]. Le spectre total qu’ils obtiennent présente un maximum d’intensité d’absorption au voisinage de 420 nm comme on peut le voir sur la figure (5.3). Il ressort de ces explications que l’intensité d’absorbance à cette longueur d’onde est directement liée à la teneur en pigments de l’extrait de poivre étudié dans notre cas.

Les échantillons ont été obtenus par extraction à froid. Plus précisément, des grains de poivre traités par le plasma ont été moulus et 1 g de la poudre obtenue a été mélangé avec 80 ml d’eau distillée. La suspension ainsi obtenue est mélangée à 200 rotation/min pendant 3 heures, et centrifugée pendant 30 min. La suspension est enfin filtrée (What- man #41 filter). La mesure d’absorbance à 420 nm est réalisée avec un spectromètre (4001/4, Thermo Fisher Scientific). Le principe de la mesure est basé sur l’atténuation de l’intensité d’un faisceau lumineux, de longueur d’onde de 420 nm, lors de son pas- sage dans un milieu absorbant (extrait de poivre dans notre cas). Le rapport entre l’intensité du signal transmit IT et celle du signal incident I0 représente la transmittance

[T = (I_T/I0) × 100]. L’absorbance A du milieu est ensuite déduite de cette dernière

Figure 5.3 – Spectre total d’absorption (courbe noire) issu de cinq types de pigments différents. La courbe rouge représente le profil d’absorption de la chlorophylle a (Thrane et al. [15]).

5.2.2.3 Mesure du pH

L’extrait du poivre a été utilisé pour déterminer les modifications de pH induites par le traitement plasma. Les échantillons ont été obtenus suivant le même protocole que celui utilisé pour les mesures de l’absorbance à 420 nm mais avec une quantité de poivre de 2 g. La mesure du pH a été réalisée à l’aide d’un pH-mètre (Hi 2221 Hanna Instruments).

5.2.2.4 Mesures colorimétriques

En plus de ses propriétés organoleptiques, la couleur d’un aliment est un paramètre important dans le domaine agroalimentaire. Les différentes étapes de traitement doivent satisfaire à la condition de préservation de la couleur d’origine du produit.

Pour évaluer l’effet des traitements plasma sur la couleur du poivre, des mesures ont été conduites afin d’extraire les coordonnées colorimétriques de nos échantillons sur l’espace des couleurs de la Commission Internationale de l’Eclairage (CIE XYZ). Moyennant certains calculs, la mesure de ces coordonnées permet de déduire les propriétés de couleur d’un corps donné et de les discriminer avec précision de celles d’un autre corps ayant des propriétés de couleur plus en moins proches.

Les mesures colorimétriques ont été effectuées à l’aide d’un spectroradiomètre (Spec- bos 1201, JETI). L’appareil capte la lumière émise par l’échantillon à travers une fente d’entrée. Un laser rouge sous forme de spot pointe sur l’échantillon pour définir la surface considérée dans la mesure. Il est possible de faire varier cette surface en changeant la distance entre l’appareil et échantillon, toutefois le constructeur conseille de garder cette distance inférieure à 100 cm afin de garantir la cohérence des résultats. Dans cet étude,

une distance de 65 cm a permis de couvrir la totalité de la boite de Pétri contenant de nos échantillons de poivre.

L’appareil est contrôlé par une interface logicielle (JETI LiVal) permettant de régler les paramètres de la mesure et de post-traiter les spectres obtenus. Après chaque acquisi- tion, le logiciel calcule un certain nombre de grandeurs caractéristiques de la couleur de l’échantillon telles que la luminance, l’éclairement, la température de couleur et l’indice de rendu de couleur. Il fournit également les coordonnées colorimétriques sur l’es- pace des couleurs du système CIE sous ses différentes représentations (XYZ ; x, y et u’, v’).

Dans notre cas, la caractérisation de la couleur du poivre a été réalisée à l’aide des coordonnées de l’espace chromatique CIE L*, a*, b* défini par la CIE en 1976 pour la caractérisation des couleurs de surface. La lettre L* renvoie à la clarté de la surface étudiée, qui peut varier entre 0 et 100, respectivement pour le blanc et le noir de référence. Les lettres a* et b* expriment l’écart de couleur par rapport à une surface grise de la même clarté, illuminée par la lumière du jour normalisée dans la norme CIE-D65. La valeur de a* est portée sur l’axe vert-rouge et la valeur de b* sur l’axe bleu-jaune (voir figure (5.4)).

Figure 5.4 – Représentation de l’espace chromatique L*a*b* CIE pour trois valeurs de la clarté L*. Les coordonnées du point PPC correspondent aux valeurs L*, a*, b* calculée pour un échantillon de contrôle (PPC : Poudre Poivre Contrôle).

Le passage des coordonnées XYZ aux coordonnées L*a*b* s’effectue moyennant les relations suivantes [160] :

    L∗= 116 f [Y /Yn] − 16 a∗ = 500 (f [X/X_n] − f [Y /Y_n]) b∗ = 200 (f [Y /Yn] − f [Z/Zn])     où f [q] = ( q1/3 si q > (6/29)3 1 3 ( 29 6)2 q + ( 4 29) sinon (5.1)

Les valeurs de Xn= 95,02, Yn =100 et Zn= 108,82 [161] représentent le tristimulus du blanc de référence du standard D65 utilisée. Une fois ce calcul effectué, il est possible d’évaluer la différence de couleur de deux corps (A et B), représentée sur l’espace chromatique par leurs coordonnées L*a*b*, en calculant la valeur du module :

∆E∗ =

q

(L∗_B− L∗

A)2+ (a∗B− a∗A)2+ (b∗B− b∗A)2 (5.2) Correspondant à la distance entre les deux couleurs dans l’espace chromatique. Dans notre cas, le paramètre ∆E∗ est calculé en utilisant les coordonnées L*a*b* des échantillons exposés au plasma en référence à celles des échantillons de contrôle (non-exposés).

5.2.2.5 Analyse du contenu en pipérine

La concentration en pipérine des échantillons de poivre traités et non-traités par plasma a été déterminée en utilisant la méthode spectrophotométrique décrite dans "asta analytical methods manual". Cette méthode est basée sur l’extraction de la pipérine dans de l’alcool dénaturé et sur la mesure de l’absorbance entre 342 nm et 345 nm. Pour cela, 0,5 g poivre en poudre a été mélangé avec 70 ml alcool dénaturé (SDA No. 3A) avant que la pipérine soit extraite par reflux pendant une heure. La suspension a ensuite été filtrée puis le volume final a été ramené à 100 ml. L’absorbance à 345 nm a été mesurée avec SDA N°. 3A comme solution référence. Pour estimer la concentration de pipérine, une courbe de calibration de 1 à 6 µg/ml a été obtenue en utilisant un standard de pipérine (Sigma-Aldrich).