Les enhancers jouent un rôle central dans l’établissement, le maintien et la réactivité des programmes transcriptionnels propres à chaque type et état cellulaires (Heintzman et al.,
et extra-cellulaires (Jin et al.,2011a) dirigés par la liaison de FTs pionniers et spécifiques responsables de coordonner la régulation des gènes cibles appropriés (Fig. 1.13). L’identi- fication des enhancers est donc cruciale à la compréhension des processus physiologiques et physiopathologiques, tels que la dérégulation de l’expression des gènes observée, no- tamment, dans les cas de cancers.
Une des façons d’identifier les enhancers est de s’attarder à leur composition en MPTs des histones en exploitant la différence dans le statut de méthylation de H3K4 entre les en- hancerset les promoteurs, sachant que les enhancers sont préférentiellement marqués par H3K4me1, alors que les promoteurs par H3K4me3 (Heintzman et al., 2007). De plus, la présence combinée de ces marques avec H3K27ac révèle leur état actif (Heintzman et al.,
2007;Ernst and Kellis, 2010;Creyghton et al., 2010;Rada-Iglesias et al., 2011;Zentner
et al., 2011). Une autre façon d’identifier les enhancers est d’analyser la structure de la
chromatine, en exploitant la différence d’accessibilité entre les régions non-régulatrices et régulatrices (Thurman et al.,2012).
Toutefois, des études récentes ont montré que l’idée communément acceptée de considérer la structure de la chromatine aux DHS, dont les enhancers, comme étant libre de nucléo- some est réfutée ou du moins à nuancer. En particulier, des études ont démontré que les DHS peuvent être associés à un fort taux d’occupation par les nucléosomes (Tillo et al.,
2010;Nili et al.,2010) et un fort degré de renouvellement des histones (Mito et al.,2007),
et être occupées par des nucléosomes instables contenant les variants d’histones H3.3 et H2A.Z (Jin and Felsenfeld,2007;Jin et al.,2009;Henikoff et al.,2009). Cette réalité serait passée inaperçue, car ces nucléosomes présents aux régions accessibles auraient tendance à être perdus durant la préparation de la chromatine si cette dernière n’a pas subi un pon- tage au formaldéhyde. Ainsi, il apparaît que la composition particulière des nucléosomes présents aux enhancers créerait un environnement chromatinien spécifique qui pourrait mo- duler la structure locale de la chromatine et participer à l’activité de cette région.
De plus, des études récentes sont venues complexifier davantage notre compréhension de la structure locale de la chromatine aux FT-SLs. En effet, il a été démontré que le modèle classique de réorganisation des nucléosomes aux enhancers suite à l’activation de la trans- cription, soit l’occlusion par un nucléosome du FT-SL avant l’activation et le remodelage
de la chromatine suite à l’activation, impliquant soit l’éjection ou le repositionnement du nucléosome afin de rendre la régions libre de nucléosome et donc accessible à la liaison (Fig. 1.20a), existe (Schones et al., 2008; He et al., 2010;Hu et al., 2011), mais qu’il ne semble pas être généralisé à tous les enhancers liés par des FTs (Wang et al., 2011; He
et al.,2012). De plus, une hétérogénéité et une asymétrie dans la configuration des nucléo-
somes autour d’un ensemble de FT-SLs ont récemment été mises en évidence (Fig. 1.21b)
(Kundaje et al., 2012), remettant également en question le modèle classique, mais le pos-
sible dynamisme associé à ce phénomène n’a pas été étudié.
Ainsi, une étude plus approfondie de l’influence de la composition de la chromatine sur la structure locale de la chromatine aux enhancers, ainsi que celle d’une liaison dynamique des FTs lors de l’activation de la transcription apparaît nécessaire.
Des études à l’échelle du génome ont identifié H2A.Z comme une composante de la chro- matine aux DHS, dont des enhancers potentiels (Barski et al.,2007;Jin et al.,2009;Ernst
and Kellis,2010). Toutefois, sa fréquence parmi les enhancers ainsi que son rôle demeurent
peu connus. Pourtant, plusieurs évidences suggèrent qu’H2A.Z serait un bon candidat pour réguler de façon dynamique la structure de la chromatine aux enhancers. D’abord, son in- corporation dans la chromatine est indépendante de la réplication et nécessite l’implication de complexes de remodelage de la chromatine (Ruhl et al., 2006;Gevry et al.,2007). La présence d’H2A.Z à une région particulière du génome sous-entend donc que le ou les nu- cléosomes concernés ont été momentanément déroulés, ou du moins perturbés, et donc que la structure de la chromatine a été modifiée. De plus, les nucléosomes contenant H2A.Z semblent moins protéger l’ADN de la digestion interne par des nucléases à ADN que ceux contenant H2A (Tolstorukov et al.,2009), suggérant un rôle direct d’H2A.Z dans la régula- tion de l’accessibilité de la chromatine. Aussi, les nucléosomes contenant H2A.Z-H3.3 se caractérisent par une hypersensibilité à la dissociation en solution de faible force ionique, qui mesure la stabilité intrinsèque du nucléosome (Jin and Felsenfeld, 2007; Jin et al.,
2009;Henikoff et al., 2009). Ils sont donc qualifiés de hautement instables. Puisque c’est
sous cette forme que la majorité de H2A.Z se retrouve aux éléments régulateurs (Jin et al.,
2009), il est donc tentant de spéculer que cette instabilité pourrait contribuer à l’accessibi- lité de la chromatine nécessaire pour la liaison des FTs à l’ADN au sein des enhancers.
À cet égard, une étude, effectuée à l’échelle du génome et utilisant AR comme modèle transcriptionnel inductible abonde dans ce sens, et suggère aussi qu’H2A.Z pourrait être impliqué dans la réorganisation des nucléosomes aux enhancers (He et al., 2010). En ef- fet, suite à son activation la liaison de AR à l’ADN implique le départ d’un nucléosome central au site de liaison, lequel serait bordé par deux nucléosomes symétriques et bien po- sitionnés. L’analyse par ChIP-qPCR de 5 loci avant l’activation montre un enrichissement de H2A.Z dans le nucléosome "sortant" (Fig. 1.20c). Ainsi, l’instabilité créée par la pré- sence d’H2A.Z pourrait faciliter la liaison initiale de AR à son site de liaison, permettant le recrutement, entre autres, de CRC-ATP et l’éjection ou le repositionnement du nucléo- some central. Toutefois, il est important de noter que l’enrichissement de H2A.Z n’a pas été validé à l’échelle du génome, ni suite à l’activation. De plus, bien que les auteurs ne prennent pas la peine de le mentionner, un enrichissement d’H2A.Z est également obser- vable dans les nucléosomes adjacents aux sites de liaison, considérés comme "constants". Or, des études de gènes spécifiques rapportent les deux types de comportements de H2A.Z suite à une activation, dynamique ou persistant (John et al.,2008;Gevry et al.,2009;Dal-
vai et al.,2013;Eeckhoute et al., 2006), suggérant que le départ d’H2A.Z aux enhancers
suivant ou précédant la liaison d’un FT ne serait pas un modèle général.
Gévry et al. (2009) ont démontré qu’H2A.Z est essentiel à l’expression de plusieurs gènes cibles de ERα dans les cellules MCF-7, et qu’une diminution d’H2A.Z dans ces cellules empêche la prolifération cellulaire induite par l’E2. De plus, en présence d’E2, H2A.Z est incorporé à un ERα-SL situé au promoteur de TFF1, un gène cible de ERα, où il per- mettrait un positionnement en translation adéquat, ce qui pourrait assurer, entre autres, le recrutement de l’ARNPII au TSS. La présence d’H2A.Z est également observée à des ERα-distaux considérés comme enhancers potentiels. Toutefois l’influence sur la structure locale de la chromatine à ces régions et son implication fonctionnelle dans l’activité des enhancersn’ont pas été déterminées. Finalement, He et al. (2012) ont observé que contrai- rement aux AR-SLs, les ERα-SLs ne présenteraient pas de profil symétrique d’occupation par les nucléosomes suite à leur activation, bien que la chromatine soit accessible, comme si ERα liait l’ADN nucléosomale. La présence d’H2A.Z pourrait expliquer ce phénomène, mais elle n’a pas été étudiée.
Il apparaît donc nécessaire à la lueur de ces observations de déterminer l’organisation des nucléosomes aux enhancers enrichies en H2A.Z et son possible dynamisme lors de la liaison des FTs.
Finalement, il est important de noter qu’H2A.Z étant enrichi aux promoteurs et aux enhan-
cers(Barski et al., 2007;Jin et al.,2009; Ernst and Kellis,2010), un défi supplémentaire
dans l’identification du rôle spécifique d’H2A.Z aux enhancers provient de la controverse entourant la présence ou non de H3K4me3 aux enhancers (Barski et al.,2007;Heintzman
et al., 2007;Ernst and Kellis, 2010; Pekowska et al., 2011; Ernst et al., 2011; Hu et al.,
2013), une marque également associée au promoteur. Il s’avèrera donc nécessaire d’éclair- cir ce point afin de prévenir une possible confusion dans l’identification du rôle spécifique d’H2A.Z aux enhancers.
L’objectif de ma thèse était donc de déterminer l’influence du variant d’histone H2A.Z sur l’organisation des nucléosomes aux enhancers liés par ERα durant l’induction du programme transcriptionnel dépendant de l’E2. Pour ce faire, nous avons défini, dans un premier temps, la composition de la chromatine aux ERα-SLs, puis identifié les enhancers potentiels liés par ERα et leur enrichissement en H2A.Z. Par la suite, nous avons vérifié s’il existait un lien entre la présence d’H2A.Z aux ERα-enhancers et l’organisation des nucléosomes. Ma thèse s’articule autour d’un article présentant les résultats obtenus suite à la mise en œuvre de ces objectifs. De plus, comme nos résultats ont révélé qu’H2A.Z n’est présent qu’à certains enhancers, où il n’introduit pas une organisation unique des nu- cléosomes, une étude des différences épigénétiques entre les enhancers occupés et ceux non-occupés par H2A.Z est apparue nécessaire afin d’éclaircir le rôle d’H2A.Z à ces ré- gions. L’ensemble de ces résultats est présenté au Chapitre 2.
Trois annexes viennent également compléter cette thèse. L’annexe I contient le protocole de MNase-seq et de MNase ChIP-seq que j’ai mis au point. L’annexe II est un protocole sur l’utilisation de VAP, Versatile Aggregate Profiler, un outil développé en collaboration par les laboratoires du Pr Pierre-Étienne Jacques et du Pr François Robert auquel j’ai participé. L’annexe III est un communiqué relatant les résultats marquants de l’étude de Akhtar-Zaidi et al.(2012) que j’ai rédigé lors d’une collaboration avec le Pr Mathieu Lupien.