Préparation et observation des nématodes au microscope optique

Pour chaque isolât ,50 mâles et 50 femelles sont péchés séparément dans la suspension de nématodes fixés et transférés dans deux piluliers. La méthode de montage à la glycérine (Seinhorst, 1959) simplifiée (Baujard, non publié) est appliquée afin d ’obtenir des montages permanents des spécimens étudiés. Après avoir aspiré la majeure partie du liquide fixateur contenue dans les piluliers, ceux-ci sont ensuite placés dans un dessiccateur à éthanol maintenu à une température de 45°C. Lorsque les piluliers sont pleins (24 heures après dans le cas présent) l’eau est alors entièrement remplacée par l’éthanol. Un mélange 95-5% d ’éthanol-glycérine est alors ajouté. Quarante huit heures après, les nématodes sont prêts pour être montés.

Un anneau de paraffine est déposé sur une lame à l’aide d ’un tube à hémolyse dont l’embout est préchauffé à la flamme. Une goutte calibrée de glycérine anhydre est placée à l’aide d ’une seringue au centre de l’anneau de paraffine. Les nématodes sont alors péchés et déposés dans la goutte de glycérine (on ne dispose qu’une dizaine de nématodes par lame pour éviter le chevauchement des spécimens). Une lamelle est ensuite déposée au dessus. Le tout est placé sur une platine chauffante pour faire fondre le bourrelet de paraffine. La lame est ôtée de la plaque chauffante pour laisser la paraffine refroidir et durcir.

Chapitre 2 : Matériels et méthodes

2.Etude morpho-anatomique de quatre isolats de Pratylenchus spp.

Les nématodes sont ensuite observés sous un microscope optique (Olympus® BH2) équipé d ’une chambre claire. Pour mesurer la longueur des individus ainsi que la position de la vulve, le profil des spécimens est tout d ’abord dessiné à l’aide de la chambre claire et à un grossissement de x 500. Les mesures sont ensuite effectuées sur le croquis à l’aide d ’un curvimètre. Les autres mesures sont réalisées directement au micromètre oculaire avec un objectif à immersion (x 100) permettant un grossissement de x 1500. Certains spécimens en position dorsale ou ventrale présentant une courbure de corps trop importante en particulier au niveau de la queue sont écartés de l’observation car les mesures ne peuvent être réalisées de manière fiable.

L’ensemble des critères morpho-biométriques décrits par Loof (1991) ont été mesurés sur les femelle des trois isolats de Pratylenchus (tableau 2.2 et annexe 6).

Une analyse factorielle discriminante (AFD) est effectuée sur les différents descripteurs morphométriques des trois isolats à l’aide du logiciel STATITCF. Cette AFD permet la construction de deux axes factoriels discriminants (variables canoniques), combinaisons linéaires des variables morphométriques initiales définissant le plan de représentation des individus appartenant aux trois isolats.

Une seconde AFD est réalisée en introduisant comme individus supplémentaires les données moyennes de différentes populations étudiées par différents auteurs afin de les comparer par rapport aux isolats de notre étude. Ces individus supplémentaires ne participent pas à la construction des axes factoriels discriminants. Ces populations sont les suivantes :

- Population paratype de P. gutierrezi(n = 30 ; hôte = Coffea arabica) (Golden et al., 1992).

- Deux populations paratypes de P. pseudocoffeae: “Miazaki” (n = 40, hôte = Chrysanthemum morifolium) et “Nagazaki” (n = 10 ; hôte = Artemisia feddei)\ décrites par Mizukubo (1992, a, b).

- Trois populations de P. coffeae: “Nagano” (n = 20; hôte = Zea mays) et “Okinawa” (n = 25; hôte = Bambusa sp.) et “Saitama” (n = 21 ; hôte = Ipomoea batatas et

Oriza sativa)(Mizukubo, 1992, a).

- Deux isolats (n = 20) initialement supposés appartenir à P. gutierrezi, prélevées sur C. arabica au Costa Rica (meseta central) et au Guatemala (= isolât Buena Vista) et

Tableau 2.2. Observations morpho-biométriques proposées par Loof (1991) et appliquées aux femelles des trois isolats de Pratylenchus.

Abréviations Définition du descripteur

L longueur du corps

a* longueur du corps plus grand diamètre du corps (en avant de la vulve) b* longueur du corps - distance de l’extrémité antérieure à la limite

oesophage-intestin

b ’* longueur du corps ^ distance de l’extrémité antérieure à l’extrémité distale des glandes oesophagiennes

c* longueur du corps longueur de la queue

c’* longueur de la queue + diamètre du corps au niveau de l’anus

V* position de la vulve: (distance de l’extrémité antérieure à la vulve + longueur du corps) X 100

STY longueur du stylet

DGO distance de la base du stylet au débouche de la glande oesophagienne dorsale NAQ nombre d ’anneaux de la queue mesuré sur la face ventrale

SPV longueur du sac post-vulvaire LQ longueur de la queue

OI distance de l’extrémité antérieure à la limite oesophage-intestin GLA distance de l’extrémité antérieure à l’extrémité distale des glandes

oesophagiennes

HZD distance de l’extrémité antérieure à l’hémizonide HZN distance de l’extrémité antérieure à l’hémizonion PEX distance de l’extrémité antérieure au pore excréteur DAV Diamètre du corps en avant de la vulve

DNA diamètre du corps au niveau de l’anus présence / absence de spermathèque spermathèque vide ou pleine

________ -_________ forme de la spermathèque____________________________________________

Chapitre 2 : Matériels et méthodes

2.Etude morpho-anatomique de quatre isolats de Pratylenchus spp.

élevées sur rondelles de carottes (Inserra et al., 1998) mais dont ce statut taxinomique est remis en question par Duncan et al. (1999) après analyse multivariée des paramètres morphométriques et surtout d ’une analyse génomique.

- Deux populations (n = 20) de P. gutierrezidirectement prélevées sur C. arabica au Costa Rica (Duncan et al., 1999). L’une est une population topotype. L ’autre correspond à la population de laquelle a été prélevé l’isolat mentionné précédemment et élevé sur rondelles de carottes.

- Deux populations (n = 20) de P. coffeaeprélevées sur Coffeasp. en Indonésie (Est de Java = localité type de P. coffeaeZimermann, 1898) et au Brésil (n = 20) (Duncan et al., 1999). La population du Brésil pourrait appartenir à une espèce différente non décrite selon ces mêmes auteurs.

- Des individus (n = 7) de collection prélevés par Sher & Allen (1953) sur Coffeasp. à Java et définis comme néotype de P. coffeae et observés par Inserra et al. (1998) et Duncan et al. (1999). Son statut taxinomique a également été remis en question par ces derniers auteurs.

Les données des holotypes ne sont pas été prises en compte car une révision détaillée de leurs caractéristiques morphométriques a montré qu’ils ne sont pas représentatifs des paratypes de la plupart des espèces ici considérées. Ce sont donc les moyennes de chaque descripteur disponible qui ont été calculées pour chacune des populations paratypes. Les variables disponibles pour toutes ces populations sont : la longueur du stylet, sty ; la longueur totale, L et les ratio, V, a, b et c.

Pour les mâles des trois isolats de Pratylenchus,seule la longueur du corps a été mesurée. Afin de comparer la longueur des mâles des trois isolats de l’étude avec celle observée chez d ’autres espèces morphologiquement proches : P. pseudocoffeae, P. gutierrezi, P. coffeae et

P. loosi, seule une comparaison graphique a pu être réaüsée puisque seules les moyennes avec les écarts types et/ou les valeurs extrêmes étaient disponibles pour ces espèces. Une représentation en boîtes de Box est réalisée à cette fin.

Par ailleurs différentes observations morpho-anatomiques des femelles de Pratylenchus sont réalisées au microscope optique.

Chapitre 2 : M atériels et méthodes

2.Etude morpho-anatomique de quatre isolats de Pratylenchus spp.

La forme générale de la partie postérieure des femelles ainsi que leur extrémité distale sont décrites en se basant sur la nomenclature établie par Tarjan & Frederick (1989) (annexe 7).

La présence ou absence de spermathèque est vérifiée. Si elle est présente, on observe son contour afin de déterminer sa forme générale : sphérique, ovale ou rectangulaire. Pour chaque spermathèque on calcule le rapport moyen du plus grand rayon (longueur dans la direction du corps) et du plus petit rayon (largeur, perpendiculairement à la direction du corps). Le contenu des spermathèques est également révisé pour déterminer si elles sont pleines.

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2.3. Préparation et observation des nématodes au microscope électronique à