Dynamique de pénétration des isolats dans les racines de caféiers

3.2.1.1. Matériel végétal

Les deux matériels végétaux utilisés pour cette étude sont:

-Pour l’espèce, C. arabica, le cultivar Catuai a été choisi pour sa grande diffusion auprès des caféiculteurs ainsi que pour sa sensibilité à la plupart des nématodes parasitant les caféiers et son utilisation fréquente dans les tests de résistance de Coffea spp. aux nématodes (Anzueto, 1993 ; Hernandez, 1997 ; voir chapitre 1 § 1.5.2).

- Pour l’espèce C. canephora, c’est la variété porte-greffe hybride F l Nemaya qui a été utilisée. Il s’agit d’un croisement entre les deux clones de cultivar Robusta T3751(l-2) et

T3 561 (2-1 ) sélectionnés principalement pour sa résistance à Meloidogyne incognita (Guatemala),

Meloidogyne sp. (Salvador) et M. exigua (Costa Rica) (ref). Les graines utilisées pour ce travail

proviennent d’une pollinisation contrôlée entre les deux plantes mères. Cette variété est à l’étape de multiplication en champs semenciers et n’est donc pas encore distribuée au stade commercial.

Les graines des deux variétés sont mises à germer dans un substrat composé de cendres volcaniques stérilisées à l’autoclave (20 minutes à 1,1 kg/cm2 de pression soit une température de 120°C). Quarante cinq jours après, les plantules, parvenues au stade feuilles cotylédonaires, sont retirées du germoir. Les plantules dont le système radiculaire a été lésé lors de cette opération sont écartées. Une sélection est ensuite effectuée sur des critères d’homogénéité de taille et d’apparence des racines. On retient en particulier celles ayant un système radiculaire “classique” avec un unique pivot et des racines latérales bien développées. Les plantules retenues sont alors plantées dans des embouts Pipetman ® de 15 mm de diamètre supérieure et 105 mm de longueur avec du sable de rivière tamisé (taille des particules : 50-850 |am) et également stérilisé par autoclave (figure 2.4). Quelques grains de sable d’une taille d’environ 2 mm sont tout d’abord disposés au fond des embouts pour permettre le drainage de l’eau tout en retenant le

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sable fin constituant le substrat principal. Le repiquage des plantules est effectué dans l’eau afin d ’assurer une répartition homogène du sable autour des racines dans l’embout Pipetman ®. Cette opération nécessite de rabattre les racines latérales avec précaution le long du pivot afin de pouvoir introduire le système radiculaire dans son entier dans les cônes sans provoquer de lésions. Ces cônes permettent de maintenir toutes les racines dans un volume réduit afin de favoriser l’infestation de celles ci par les nématodes ensuite inoculés. En fin d ’opération, les plantules dans leurs cônes sont retirées de l’eau dont l’excès est évacué par l’ouverture inférieure du cône. Les plants sont acclimatés en serre durant 15 jours en disposant les cônes verticalement dans un récipient. Pendant les 12 premiers jours, on procède à une humectation journalière des feuilles par nébulisation, le substrat étant humidifié par capillarité en révisant quotidiennement que le niveau d ’eau au fond du récipient contenant les cônes se maintienne à environ 1 cm. Durant les trois derniers jours avant inoculation des nématodes, l’eau est retirée du récipient contentant les cônes et seule est appliquée l’humectation journalière des feuilles par nébulisation. Ceci permet d’avoir au moment de l’inoculation des nématodes des plants sans stress hydrique mais sans excès d ’eau qui pourrait par la suite provoquer une perte d ’inoculum.

3.2.1.2. M éthodes d ’inoculation

L’inoculum provient des trois isolats Moca, Chamtaca et Chitalon, multipliés en élevage monoxénique sur disques de carottes in vitro. Les nématodes récupérés par simple lavage des parois des flacons d ’élevage sont mis en suspension soumise à une oxygénation durant 30 minutes par insufflation d ’air afin d ’augmenter la motilité des nématodes. Ces suspension sont ensuite ajustées à une concentration de 200 nématodes par ml d ’eau. Les individus immobiles ne sont pas pris en compte. De même, les oeufs, peu nombreux, ne sont pas pris en compte. Chaque plant reçoit une inoculation de 300 nématodes, soit 1,5 ml de la suspension préparée qui est appliquée à l’aide d ’un Pipetman 2000 ® . Ce volume correspond en moyenne à la capacité de rétention du substrat contenu dans les cônes dans les conditions de l’étude. On obtient ainsi une répartition homogène de ce volume avec un minimum de ressuyage afin de diminuer les risques de pertes de l’inoculum par lavage dans le substrat. Lorsqu’une goutte d ’eau est ressuyée, dans certaines répétitions, suite probablement à une humidité résiduelle du substrat, celle ci est observée au

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humectation journalière des feuilles par nébulisation est effectuée pour maintenir les plantules dans des conditions favorables d ’hygrométrie. Les plantules sont exposées à une lumière naturelle indirecte.

Les trois isolats Moca, Chamtaca et Chitalon sont inoculés sur Coffea arabica cv. Catuai. Sur Coffea canephoracv. Nemaya, seuls les deux isolats Moca et Chitalon sont inoculés.

3.2.I.3. Méthodes d ’observation des racines et des nématodes

Préparation des racines :

Les plantules sont extraites des cônes, 24, 48 et 96 heures après inoculation. L’opération est effectuée dans un bac d ’eau afin d ’éviter au maximum toute lésion du système racinaire qui est ensuite soigneusement et délicatement lavé (sous robinet d’eau à faible débit). Les racines sont ensuite colorées à la fuchsine acide (annexe 12) bouillante durant 30 secondes. Ce temps a été déterminé après plusieurs tests. Il permet une coloration globalement satisfaisante de l’ensemble du système radiculaire hétérogène quant au diamètre et au stade de lignification des racines (pivot de plus grand diamètre et plus lignifié par rapport aux racines latérales primaires et secondaires). Il permet une bonne coloration des nématodes en évitant toutefois une surcoloration des racines les plus fines (figure 2.4). Les racines sont ensuite immédiatement retirées de la fuchsine acide et rincées à l’eau. Après avoir enlevé l’excès d ’eau avec du papier absorbant, les racines sont totalement immergées dans une solution de lactoglycérol (annexe 12) afin d ’éliminer l’excès de colorant des tissus végétaux. Cette solution de décoloration est renouvelée après un délai de 2 jours, puis de 8 jours et enfin de 15 jours. Les racines peuvent être alors conservées dans le

lactoglycérol durant plusieurs mois.

Observations sur racines écrasées :

Les systèmes radiculaires décolorés sont découpés en différentes parties afin de permettre leur écrasement puis observation entre lame et lamelle. Les racines latérales, encore non-ramifiées à ce stade de développement, sont séparées du pivot à l’aide de ciseaux fins. Quant au pivot, il est découpé en trois parties égales ou étages sur la longueur du pivot: inférieur, médian et supérieur. Les différentes racines ou parties de racines sont alors disposées sur une lame dans un goutte de glycérol, puis écrasées sous un film acétate. L’écrasement des racines doit être aussi

Figure 2.4. A : Jeune plantule de Coffea sp. (stade cotylédonaire) transplanté dans un embout de Pipetman de 105 mm de longueur et 15 mm de diamètre supérieur, rempli de sable de rivière tamisé (50-850(j,m) ; B : Système radiculaire après coloration à la fuchsine acide.

zone proximale zone ditale

épiderme cotex

cylindre vasculaire ^coiffe

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délicat que possible afin de conserver l’organisation des tissus et permettre ainsi l’observation des nématodes en place. Concernant les trois tronçons du pivot correspondant aux trois étages observés, ils sont coupés longitudinalement afin d’en extraire le cylindre central. Cela permet un meilleur écrasement du cortex et donc une meilleure observation des nématodes. Les lames sont observées au microscope optique afin de dénombrer les nématodes. Sur chacune des racines latérales, l’emplacement des nématodes est également relevé selon trois zones : l’extrémité proximale ou zone de jonction avec le pivot d ’une longitude d ’environ 2 mm; la zone médiane généralement couverte de poils absorbants sur une bonne partie de sa longueur et avec une longitude variant de 20 à 50 mm; et l’extrémité distale ou zone de croissance comprenant la zone méristématique, la zone d ’élongation et la zone de différenciation (début de la région des poils absorbants) (figure 2.5).

Sur Coffea arabica cv. Catuai, les observations pour chaque isolât (Moca, Chamtaca, Chitalon) et date d’observation (24,48 et 96 h) sont réalisées sur cinq plantules. Sur ce matériel, 45 plantules sont donc observées. Sur Coffea canephora cv. Nemaya, les observations portent sur 30 plantules (deux isolats [Moca, Chitalon] x trois dates x cinq répétitions).

Les données de populations totale de nématodes ayant pénétré dans les racines sont transformées en log [x+1] pour homogénéiser les variances afin de réaliser les analyses de variance. Pour chaque date d ’observation, une analyse de variance est effectuée sur les données correspondantes à l’aide du logiciel STATITCF. Les moyennes sont classées par le test de Newman et Keuls (.P < 0,05).

Afin d ’analyser les données sur la distribution des nématodes dans le système radiculaire, une analyse de variance est réalisée pour chaque isolât sur l’ensemble des données de populations de nématodes obtenues aux trois dates d ’observation. Deux analyses sont effectuées séparément, l’une sur l’ensemble des racines latérales, en comparant les données des trois zones prédéfinies, proximale, médiane et distale ; et l’autre sur le pivot, en comparant les données des trois étages inférieur, médian et supérieur.

Concernant les racines latérales, pour tenir compte des différences de longueur des zones proximale, médiane et distale, une longueur moyenne de chacune d ’elle est estimée pour en déduire la densité de nématode par mm linéaire de racines.

Chapitre 2 : M atériels et méthodes

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Observations histologiques sur coupes de racines :

Une étude complémentaire histologique a été réalisée à partir de racines des deux matériels génétiques testés dans cette étude : C. arabica cv. Catuai et C. canephora cv. Nemaya. Des racines saines et parasitées par des nématodes de l’isolat Chitalon 96 h après inoculation, déjà traitées par la coloration à la fuchsine acide sont utilisées pour réaliser des coupes histologiques. Des tronçons de ces racines sont fixés au glutaraldéhyde paraformaldéhyde caféine, déshydratés dans l’éthanol et inclus dans le glycolméthacrylate pour être découpés au microtome à 7 pm. Les coupes sont colorées à l’acide périodique Schiff (APS) Naphtol Blue Black (annexe 11). Les coupes sont ensuite observées au microscope optique.