7.3 Peptides issus de l’aptam`ere RG 27
7.3.2 Peptides cycliques
L’aptam`ere RG 27 ayant montr´e de tr`es bonnes qualit´es d’interaction avec RasGAP-SH3, nous nous sommes int´eress´es `a la synth`ese de peptides cycliques issus de sa r´egion variable. Nous avons tent´e trois types de cyclisation :
– head-to-tail par formation d’une liaison peptidique : cette cyclisation sur r´esine n’ayant pas encore donn´e de r´esultat positif et ´etant en tous points semblable `a celle d´ecrite plus haut (p. 154), nous ne la d´ecrirons pas ici,
– cyclisation par pont disulfure, – cyclisation par pont thio´ether.
Cyclisation par formation d’un pont disulfure
Nous avons synth´etis´e comme expos´e pr´ec´edemment le peptide suivant, dans l’objectif de cr´eer un pont disulfure entre les thiols des chaˆınes lat´erales des cyst´eines :
CGPKWVVSHARLMYSFGPC
De nombreuses m´ethodes sont d´ecrites dans la litt´erature pour la cyclisation de peptides par cr´eation d’un pont disuflure. Certaines des approches d´ecrites font appel `a une cyclisation sur r´esine (Berezhkovskiy et al., 1999,Albericio et al., 1991, Garc´ıa-Echeverr´ıa et al., 1989) ou en solution (Berezhkovskiy & Deshpande,2000,Garay et al.,2000,Tam et al.,1991).
Nous avons choisi pour la simplicit´e de sa mise en œuvre une technique de cyclisation en solution, par action oxydante de l’oxyg`ene pr´esent dans l’air, en conditions basiques et `a tr`es faible concentration de peptide.
Apr`es d´eprotection, clivage et purification sur HPLC, nous avons alors r´ealis´e la cyclisation proprement dite, en phase liquide `a tr`es faible concentration, pour ´eviter au maximum la forma- tion de complexes intermol´eculaires, et favoriser la formation du pont disulfure intramol´eculaire. Tr`es simplement, nous avons plac´e le peptide lin´eaire, pr´ealablement solubilis´e dans du m´e- thanol (environ 5 mg dans 200 mL), en conditions basiques (`a l’aide de faibles quantit´es de tampon hydrog´enocarbonate d’ammonium NH+4/HCO–3 0,1 M) et en pr´esence d’oxyg`ene ap- port´e par l’air ambiant bulle `a bulle dans la solution. Nous avons alors r´ealis´e un suivi par HPLC de la cyclisation, en fin de r´eaction (environ 5 heures apr`es ajout du tampon basique). Apr`es ´evaporation du m´ethanol et lyophilisation, nous avons pu obtenir seulement environ 1 mg de peptide cyclique pur (`a partir de 5 mg de peptide lin´eaire).
La figure 7.7 pr´esente les r´esultats de l’analyse par HPLC des produits de cette cyclisation. Sur la figure 7.7(d), on voit nettement que le peptide cyclique pur a une r´etention sur colonne C18 diff´erente du peptide lin´eaire.
Nous avons ´egalement v´erifi´e par spectrom´etrie de masse l’identit´e des produits obtenus, et montr´e que les peptides cycliques et lin´eaires avaient bien une diff´erence de m/z de 2, correspon- dant aux deux protons dont le d´epart permet la formation du pont disulfure, selon l’´equation r´eactionnelle suivante :
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C SH NH2 G P K W V V S H A R L M Y S F G P C SH COOH C S NH2 G P K W V V S H A R L M Y S F G P C S COOH + H2
Le rendement de cette cyclisation est donc tr`es faible, et la relative fragilit´e de la liaison disulfure nous a conduit `a rechercher d’autres m´ethodes de cyclisation. Cependant, on peut toutefois noter que cette exp´erience est relativement facile `a mettre en œuvre (tr`es peu d’´etapes apr`es la synth`ese peptidique).
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Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Vol ts 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 19.1 19.6(a) Peptide lin´eaireapr`es purification(le second produit minoritaire, apparu au bout de quelques heures en solution est probablement le peptide cyclique)
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Vol ts 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 18.4 19.0 20.9 22.3 23.4
(b) Peptide apr`es cyclisation, avant purification
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 V ol ts 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 19.1 19.6 23.4 (c) Co-injection de 7.7(a) et 7.7(b) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 V ol ts 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 19.0
(d) Peptide cyclique apr`es purification
Fig. 7.7 – Cyclisation du peptide issu de la r´egion variable de RG27. Le peptide lin´eaire est ´elu´e `a 63,0% B, le peptide cyclique `a 61,4% B. Chromatogrammes HPLC (colonne C18), gradient
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160 Peptides issus de l’aptam`ere RG 27
Cyclisation par formation d’un pont thio´ether
La cyclisation par formation d’un pont thio´ether permet l’obtention de peptides cycliques ayant une stabilit´e bien plus importante que les peptides cyclis´es par un pont disulfure, qui s’ouvrent en milieu r´educteur ou acide.
Diff´erentes m´ethodes d’obtention de cette cyclisation sont d´ecrites dans la litt´erature.Roberts
et al. (1998) ont ainsi propos´e la formation de ce pont thio´ether par r´eaction d’un groupement
amine bromo-ac´etyl´e et du thiol de la chaˆıne lat´erale d’une cyst´eine. Le groupe de P. Roller a quant `a lui obtenu des peptides cyclis´es par un pont thio´ether (obtenu par r´eaction d’une amine chloro-ac´etyl´ee avec le thiol d’une Cyst´eine) ayant la capacit´e d’inhiber les interactions du domaine SH2 de la prot´eine Grb2 (Long et al.,1999a,b,Lung et al.,1999).
G P K W V V S H A R L M Y S F G P C SH CO G N H Resin Pmc Trt
boc boc tBu tBu tBu
C O ClCH2 G P K W V V S H A R L M Y S F G P C SH CO G NH2 Resin Pmc Trt
boc boc tBu tBu tBu
ClCH2CHOOH/DCC/DCM G P K W V V S H A R L M Y S F G P C SH G N H C O ClCH2 COOH G P K W V V S H A R L M Y S F G P C S G N H C O COOH CH2 deprotection / cleavage cyclisation pH 8 / 7h
Fig. 7.8 – Cyclisation par formation d’un pont thio´ether du peptide issu de l’aptam`ere RG 27 La cyclisation de ce peptide est actuellement en cours, les r´esultats de cette synth`ese devraient ˆetre disponibles avant la soutenance de cette th`ese.
Conclusion du chapitre 7
La synth`ese peptidique en phase solide nous a donc permis d’obtenir de nombreuses mol´ecules avec une relative facilit´e.
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Chapitre 8
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Evaluation des affinit´es des peptides
synth´etis´es
L’objectif de ce chapitre est de pr´esenter les r´esultats des mesures d’affinit´e (obtenus prin- cipalement par mesure d’anisotropie de fluorescence) entre le domaine SH3 de RasGAP et les peptides synth´etiques pr´esent´es au chapitre pr´ec´edent.
Ce chapitre va donc logiquement commencer par une pr´esentation rapide de la technique de production du domaine SH3 par expression bact´erienne et purification, avant de pr´esenter les r´esultats de ces mesures d’affinit´es. Enfin, nous pr´esentons bri`evement les r´esultats que nous avons ´egalement obtenus par spectroscopie par corr´elation de fluorescence, qui compl`etent l’´etude par anisotropie de fluorescence.
8.1
Expression et purification du domaine SH3 de RasGAP
Les ´etudes structurales et biophysiques n´ecessitent de pouvoir produire en grandes quantit´es le domaine SH3 de RasGAP recombinant, avec le moins possible de diff´erences entre le domaine SH3 tel qu’il se pr´esente au sein de la prot´eine endog`ene et la prot´eine recombinante obtenue. Notamment, il ´etait imp´eratif que le domaine purifi´e soit de la taille la plus faible possible pour faciliter l’interpr´etation des spectres RMN.