Le tableau 6.1 r´ecapitule les r´esultats de toutes les exp´eriences de validation des aptam`eres que nous avons obtenus. Ces diff´erentes exp´eriences s’apparentent donc `a un filtre, permettant de s´electionner, parmi les aptam`eres identifi´es sur de simples informations de double-hybride, ceux poss´edant les meilleures affinit´es et activit´es cellulaires. Les ´etapes suivantes (synth`ese peptidique, ´etude structurale, mod´elisation mol´eculaire, drug design, criblage `a haut d´ebit, cf. p. 95) ne pouvant ˆetre r´ealis´ees que sur un faible nombre d’aptam`eres diff´erents, la mise au point et l’utilisation d’un tel ensemble d’outils de validation des aptam`eres revˆet une importance toute particuli`ere.
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146 S´election des aptam`eres pour ´etude ult´erieure
Bq. # 2-H l. Pull-down CFCA Viabilit´e 2-H m. Score final
TrxA/R TrxH SH3pur. HeLa
1 re g´ en ´er at ion (T rx A , 16 m er s) RG 01 ✦ ✦ ✦ ✦ ✽✽✽✾✾ RG 02 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 03 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 04 ✦ ✦ ✽✾✾✾✾ RG 05 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 06 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 07 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 08 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 0914 ✦ ✦ ✦ ✦ ✦ ✦ ✽✽✽✽✾ RG 10 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 11 ✦ ✦ ✦ ✦ ✾✾✾✾✾ 2 e g´ en ´er at ion (T rx R , 13 m er s) RG 17RG 18 ✦✦ ✾✾✾✾✾✾✾✾✾✾ RG 19 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 20 ✦ ✦ ✽✾✾✾✾ RG 21 ✦ ✦ ✦ ✽✽✾✾✾ RG 23 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 25 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 26 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 27 ✦ ✦ ✦ ✦ ✦ ✦ ✦ ✽✽✽✽✽ RG 28 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 29 ✦ ✾✾✾✾✾ RG 30 ✦ ✦ ✽✾✾✾✾
Tab. 6.1 – R´esultats des validations16. Le score final tient compte de l’ensemble des tests effectu´es sur les diff´erents aptam`eres.
De fa¸con tr`es logique, les phases ult´erieures de nos travaux se sont tout d’abord concentr´es sur l’aptam`ere RG 01, que nous avons identifi´e en premier lieu et dont les caract´eristiques per¸cues lors des phases de validation pr´esent´ees dans ce chapitre sont raisonnablement int´eressantes. L’aptam`ere RG 09 aurait ´egalement m´erit´e un int´erˆet particulier s’il n’avait eu une longueur r´edhibitoire (sa r´egion variable compte 54 acides amin´es, voir figure 5.1, p. 120) pour la synth`ese peptidique et a fortiori l’analyse structurale ult´erieure. Nous nous sommes alors tr`es logiquement
15. L’aptam`ere RG 09 comporte une r´egion variable de 52 acides amin´es. De ce fait, et en d´epit de ses qualit´es d’interaction avec RasGAP-SH3, il ne pr´esente qu’un faible int´erˆet pour l’´etude structurale ult´erieure, et poss`ede donc un score global inf´erieur `a celui de RG 27.
16. Signification des en-tˆetes de colonne :
– 2-H l. : double-hybride en levure (TrxH : transfert de l’aptam`ere dans la thior´edoxine humaine, cf. p. 128), – Pull-down : pull-down de RasGAP-SH3 (cf. pp. 137-137),
– CFCA : Colony-Forming Chemosensitivity Assay (cf. p. 140),
– Viabilit´e : tests colorim´etriques de viabilit´e cellulaire apr`es expression des aptam`eres (cf. p. 138) – 2-H m. : double-hybride en cellules de mammif`ere (cf. p. 142).
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concentr´es sur les meilleurs aptam`eres issus du crible de la banque de seconde g´en´eration, RG 20, 21, 30, et surtout RG 27, ainsi que sur l’aptam`ere RG 01 de premi`ere g´en´eration.
En plus de la d´emonstration de la validit´e de notre approche et de notre cible, ces ´etapes de validation sur cultures cellulaires sont particuli`erement cruciales dans le cadre de notre d´e- marche. En effet, le caract`ere combinatoire de la technique des aptam`eres peptidiques permet l’interrogation des surfaces prot´eiques17, et sont capables de reconnaˆıtre diff´erents sites de fixa- tion dont la pertinence dans un but th´erapeutique n’est probablement pas ´equivalente. Cette ´etape nous permet de ne pas poursuivre inutilement des ´etudes complexes sur des aptam`eres ne reconnaissant pas le « bon » site.
17. Comme nous l’avons vu au chapitre pr´ec´edent, en montrant que les diff´erents aptam`eres que nous avons obtenus n’interagissent pas tous sur le mˆeme site `a la surface de RasGAP-SH3.
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Chapitre 7
Synth`ese peptidique de r´egions
variables
L’objectif de ce chapitre est de d´ecrire les exp´eriences qui nous ont permis, `a partir des s´equences des r´egions variables des aptam`eres, d’obtenir des mol´ecules de plus petite taille, se prˆetant plus facilement aux ´etudes biophysiques et structurales, et repr´esentant une nette avanc´ee vers la conception de « petites mol´ecules », soit par modification progressive de ces premi`eres mol´ecules, soit par criblage de chimioth`eques.
7.1
Peptides lin´eaires et cycliques : hypoth`eses de travail
La Thioredoxin d’Escherichia coli, utilis´ee comme plate-forme de pr´esentation des r´egions variables des aptam`eres dans le syst`eme que nous avons mis en œuvre, est une prot´eine globulaire dont le site actif est constitu´e par deux Cyst´eines. L’activit´e catalytique de cette prot´eine consiste en la r´egulation du potentiel oxydo-r´educteur intra-cellulaire (Holmgren, 1989). Cette activit´e est obtenue par r´eduction/oxydation d’un pont disuflure entre ces deux Cyst´eines. La prot´eine native Thioredoxin poss`ede une tr`es courte boucle entre ces deux Cyst´eines, constitu´ee par la s´equence -CGPC-. La structure de la Thioredoxin native a ´et´e r´esolue par RMN dans ses deux ´etats oxyd´e (pont disulfure entre les deux Cyst´eines) et r´eduit (thiols) : mˆeme en l’absence du pont disulfure, les deux Cyst´eines du site actif sont tr`es proches (PDB : Thioredoxin oxyd´ee, 1XOA et r´eduite, 1XOB,Jeng et al.,1994).
La r´egion variable des aptam`eres que nous avons s´electionn´es est une boucle de 13 `a 16 acides amin´es ins´er´es pr´ecis´ement au sein de cette boucle, entre les deux Cyst´eines :
-CGP-[boucle variable] -GPC-
Dans le cas de la banque `a 13 acides amin´es que nous avons utilis´ee dans la seconde s´erie d’exp´eriences, les deux Cyst´eines sont remplac´ees par des S´erines.
1re hypoth`ese : L’insertion de la boucle variable ne modifie pas la structure
g´en´erale de la plate-forme
Nous faisons l’hypoth`ese que la structure des deux extr´emit´es de la r´egion variable n’est pas trop modifi´ee. Les distances de ces extr´emit´es sont donc encore suffisamment proches pour que la
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150 Peptides lin´eaires et cycliques : hypoth`eses de travail
contrainte structurale impos´ee par la Thioredoxin puisse ˆetre mim´ee par une liaison quelconque des deux extr´emit´es de la r´egion variable (par exemple un pont disulfure).
L’insertion de cette r´egion variable ne provoque g´en´eralement pas de modification structurale importante de la plate-forme Thioredoxin (Kochoyan & Yang,2004, r´esultats non publi´es), d’apr`es l’allure des spectres RMN obtenus.
2e hypoth`ese : Reconnaissance par la r´egion variable
Nous formulons une seconde hypoth`ese : la plate-forme de pr´esentation ne joue qu’un faible rˆole dans la reconnaissance de RasGAP-SH3 par les aptam`eres. Cette hypoth`ese peut ˆetre justifi´ee par le mode de s´election utilis´e, qui compare l’interaction d’aptam`eres ne diff´erant que par leurs r´egions variables. Cette hypoth`ese a ´et´e partiellement v´erifi´ee exp´erimentalement : l’´equipe de biologie mol´eculaire d’Aptanomics a pu montrer que le remplacement de la Thior´edoxine bact´erienne par son paralogue humain (dont la similarit´e est relativement faible) n’alt`ere pas la reconnaissance du domaine SH3 par la boucle variable de l’aptam`ere RG 27 (cf. p. 128). De cette hypoth`ese d´ecoule qu’un peptide synth´etique compos´e uniquement de la r´egion variable de l’aptam`ere devrait interagir de fa¸con similaire `a l’aptam`ere entier avec RasGAP-SH3.
3e hypoth`ese : Cyclisation / peptide lin´eaire
La contrainte conformationnelle impos´ee par la Thioredoxin sur la structure de la boucle va- riable des aptam`eres joue obligatoirement un rˆole important dans la reconnaissance du domaine SH3 par l’aptam`ere. Notre objectif ´etant dans un premier temps de nous s´eparer de la Thiore- doxin pour obtenir des peptides de faible taille, nous formulons l’hypoth`ese qu’une cyclisation des extr´emit´es d’un peptide de mˆeme s´equence que la r´egion variable d’un aptam`ere, permettra d’obtenir une mol´ecule ayant des propri´et´es similaires `a l’aptam`ere entier.
La cyclisation de peptides est une technique fr´equemment utilis´ee pour obtenir des mimes de fragments prot´eiques, car elle permet de contraindre ces fragments `a adopter une conformation pr´ef´erentielle. Notamment, cette m´ethode permet de cr´eer des conditions propices `a l’´etablisse- ment de liaisons hydrog`ene semblables `a celles qui structurent les feuillets β. De plus, la protec- tion des extr´emit´es N- et C-terminales par une cyclisation de type head-to-tail (tˆete `a queue) procure une relative protection de ces peptides vis `a vis des prot´eases extra et intra-cellulaires
(Shibata et al.,2003).
Les diff´erentes m´ethodes de cyclisation de peptides ont fait l’objet de nombreuses publications et de plusieurs revues, notamment celles de Lambert et al. (2001) ou de Li & Roller (2002). La cyclisation peut notamment ˆetre per¸cue comme une voie importante de modifications de peptides afin d’en faire des mol´ecules susceptibles d’ˆetre utilis´ees en th´erapeutique (voir par exempleAdessi & Soto,2002).
Concernant notre probl`eme pr´ecis et la pr´esence des deux Cyst´eines mentionn´ees, nous avons tent´e dans un premier temps une cyclisation en cr´eant un pont disulfure entre leurs chaˆınes lat´erales. Dans un second temps, et pour obtenir une meilleure stabilit´e de la cyclisation, nous avons cherch´e `a mimer ce pont disulfure par d’autres types de cyclisations.
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Fig. 7.1 – Thioredoxin native et avec une boucle de 16 acides amin´es ins´er´ee dans le site actif.A gauche : Structure PDB 1XOA. A droite : figure obtenue par mod´elisation mol´eculaire, en rempla¸cant la boucle -CGPC- par la s´equence de la r´egion variable de l’aptam`ere RG 01.
Nous avons donc propos´e diff´erentes cyclisations :
– Pont disulfure : la Thioredoxin native poss´edant d´ej`a deux Cyst´eines (susceptibles de former un pont disulfure), nous avons utilis´e cette propri´et´e pour construire des peptides cycliques, – Head to tail en utilisant les chaˆınes principales ou lat´erales d’acides amin´es (Lysine ou Acide Glutamique notamment) pour construire une liaison peptidique suppl´ementaire cy- clisant le peptide,
– Pont thio´ether : construction d’une liaison thio´ether en utilisant le thiol d’une cyst´eine et la chaˆıne lat´erale d’un autre acide amin´e du peptide (Roberts et al.,1998).