L’importante surface d’interaction entre les domaines SH3 et leurs ligands4 rend tr`es difficile
la conception de petites mol´ecules pouvant, selon les crit`eres des « Cinq R`egles de Lipinski5 » ˆetre utilis´ees comme mol´ecules th´erapeutiques. Bien ´evidemment, les peptides que nous avons con¸cus et qui sont pr´esent´es dans ce manuscrit ne respectent pas ces r`egles.
Cependant, une meilleure connaissance des caract´eristiques des sites d’interaction impliqu´es dans ces reconnaissances devrait permettre dans certains cas d’identifier de petites mol´ecules inhibitrices de domaines SH3.
De plus, l’obtention de peptides poss´edant une activit´e anti-tumorale (sur mod`eles cellulaires par exemple) ciblant une interaction donn´ee est un tr`es bon moyen de valider cette cible6.
En prenant pour cible non pas le domaine SH3, mais son ligand,Oneyama et al.(2002) ont identifi´e une petite mol´ecule, UCS15A, capable d’inhiber l’interaction Sam68/Src, qui reconnaˆıt non pas le domaine SH3 de Src, mais la r´egion riche en proline de Sam68 (voir ´egalement la figure 3.5 et Oneyama et al.,2003).
OH O H O Me Me O H Me OH Me H OH O CHO OMe
Fig.3.5 – UCS15A : inhibiteur de l’interaction Sam68/Src, se fixant sur la r´egion riche en proline de Sam68
4. Voir par exemple la figure 3.4, sur laquelle apparaissent nettement que trois poches de reconnaissance sont impliqu´ees dans l’interaction.
5. Les cinq r`egles de Lipinski et al. (2001), qui sont propos´ees pour ´ecarter en premi`ere instance certaines mol´ecules avant tout d´eveloppement pr´eclinique ou clinique, sont :
– masse mol´eculaire inf´erieure `a 500,
– c log P < 5 (crit`ere d’hydrophobicit´e, obtenue par mesure ou par calcul), – nombre de sites donneurs de liaisons hydrog`enes inf´erieur `a 5,
– nombre de sites accepteurs de liaisons hydrog`enes inf´erieur `a 10, – nombre de cycles fusionn´es inf´erieur `a 5.
6. Pour une liste relativement compl`ete de peptides ayant ce type d’activit´e, on pourra par exemple se reporter `
a la revue de Janin (2003). Berg (2003) a ´egalement publi´e une revue des diff´erentes m´ethodes ayant permis d’identifier ou de concevoir de petites mol´ecules inhibitrices d’interactions prot´eine-prot´eine.
II
La recherche d’inhibiteurs non peptidiques de domaines SH3 par criblage `a haut d´ebit de chimioth`eques est en cours actuellement. Les premiers r´esultats ont ´et´e publi´es par plusieurs ´equipes (voir notammentInglis et al.,2004). L’approche rationnelle, par modification de peptides issus de prot´eines connues pour leur interaction avec des domaines SH3 a donc pour l’instant ´et´e privil´egi´ee7. On peut notamment citer d’importants travaux de modification s´elective des diff´erents acides amin´es de l’h´elice poly-proline du peptide issu de Sos reconnaissant les domaines SH3 de Grb-28 (Nguyen et al., 1998, 2000). Le principe de ces travaux consiste principalement
`a tenter d’am´eliorer `a la fois l’affinit´e et la sp´ecificit´e de l’inhibition de ces interactions par des pepto¨ıdes (peptides dont certains acides amin´es sont non naturels). Ainsi, l’utilisation d’acides amin´es N-substitu´es en remplacement des prolines en positions P2 et P−1 (voir figure 3.6) s’est
r´ev´el´ee une voie de recherche int´eressante.
Requires C-substituted residue (proline or normal amino acid) Requires N-substituted residue (proline or peptoid) Flanking basic residue
(a) Amino terminus Carboxyl terminus SH3 surface P 3 2 P 1 P 0 P –2 P –3 P –1 P PxxP binding grooves Specificity pocket (a) NH -2Y E V P P P V P P R R R -CONH2 3 2 1 0 –1 –2 –3 P P P P P P P Site: Sos peptide: P - x P - R x Consensus motif: - - - - - (b)
Fig. 3.6 – Nguyen et al. (2000) ont propos´e des modifications des prolines en positions P2 et
P−1, en les rempla¸cant par des acides amin´es N-substitu´es non naturels.
Feng et al. (1996) ont obtenu par chimie combinatoire plusieurs familles de modifications
de ligands peptidiques du domaine SH3 de Src (voir figure 3.7). Chen et al. (1993) avaient d´ej`a r´ealis´e des travaux semblables, mais concernant la recherche d’inhibiteurs peptidiques du domaine SH3 de PI3K. N N O O N NH2 O O PLPPLP NH2 (a) NL-1 N N S N O O PLPPLP NH2 H O (b) NL-2
Fig. 3.7 – Quelques mol´ecules propos´ees parFeng et al. (1996) comme inhibiteurs du SH3 de Src.
7. Dans ce cadre, on peut ´egalement citer les travaux de Brannetti et al. (2000), qui ont mis au point un algorithme permettant de pr´edire (`a partir des nombreuses donn´ees de la litt´erature), connaissant la structure cristallographique d’un quelconque domaine SH3, la s´equence et la structure de peptides interagissant avec ce domaine.
8. L’interaction Grb2/Sos est probablement l’interaction SH3/« peptide riche en proline » la plus ´etudi´ee (voir par exemple le tableau C.1).
II
72 Conception d’inhibiteurs de domaines SH3
Conclusion du chapitre 3
Les domaines SH3 constituent donc des cibles d’un type nouveau dans le cadre `a la fois de la conception rationnelle et du criblage `a haut d´ebit de chimioth`eques, dans l’objectif d’obtenir des inhibiteurs de la signalisation `a vis´ee th´erapeutique. Cependant, leur forte compacit´e et leur petite taille devraient permettre le succ`es de telles d´emarches.
II
Chapitre 4
La prot´eine RasGAP
4.1
G´en´eralit´es
La prot´eine RasGAP (Ras GTP-ase Activating Protein) est une prot´eine de 120kDa1, com-
pos´ee principalement d’un domaine GAP C-terminal, et d’une r´egion N-terminale comprenant plusieurs domaines : notamment un domaine SH3 encadr´e par deux domaines SH2, un domaine PH (Plextrin Homology Domain) et un domaine C2 (pKC-conserved region 2 ´egalemment d´e- nomm´e CaLB, pour Ca2+-dependent Lipid Binding Domain).
Cette prot´eine est exprim´ee dans tous les types cellulaires.
SH2 PH C2 GAP SH2 181 256 351 443 596 692 1047 717 1026 494 574 279 341 SH3 455 157 Caspase
cleavage site 1 cleavage site 2Caspase
Fig. 4.1 – Les diff´erents domaines composant la prot´eine RasGAP
Localisation chromosomique Le g`ene RASA1 dont RasGAP est le principal produit est port´e par le locus 5q13 (Hsieh et al.,1989).
Le syndrome CM-AVM Ce locus a r´ecemment ´et´e identifi´e parEerola et al.(2002) comme ´etant impliqu´e dans des cas d’anomalies familiales du d´eveloppement vasculaire (« taches de vin »). Ce mˆeme groupe a d´emontr´e peu apr`es que le g`ene RASA1 ´etait directement responsable de ce ph´enotype, par des mutations inactivantes h´et´erozygotes (Eerola et al.,2003). Ce syndrome li´e `a RASA1 a ´et´e appel´e par ces auteurs « CM-AVM » (capillary malformation-arteriovenous malformation). Les ph´enotypes observ´es s’expliquent par l’implication de RasGAP dans de nom- breuses voies de signalisation li´ees `a des r´ecepteurs aux facteurs de croissance, contrˆolant la prolif´eration, la migration et la survie de diff´erents types cellulaires, et notamment des cellules endoth´eliales vasculaires. Il s’agit de la seule maladie g´en´etique h´er´editaire li´e `a RASA1 d´ecrite.
1. Une autre isoforme de 100kDa (diff´erant par sa partie N-terminale et poss´edant ´egalement une activit´e GAP) est exprim´ee dans certains tissus, notamment le placenta, mais nous n’en discuterons pas ici, ´etant donn´e que son implication dans des cancers n’a jamais ´et´e mise en ´evidence (Zhang et al.,1993).
II
74 R´egulation
Mutations de RASA1 et cancer Ras est mut´e dans un grand nombre de cancers, principa- lement au niveau d’acides amin´es impliqu´es dans l’activit´e GTPase intrins`eque de Ras ou dans la liaison de Ras `a RasGAP. Ces prot´eines mutantes ne sont alors plus capables d’hydrolyser le GTP, mˆeme avec le concours d’une prot´eine `a activit´e GAP telle que RasGAP et restent donc constitutivement actives. Friedman et al. (1993) ont recherch´e dans une large collection de tu- meurs des mutations non pas des g`enes Ras, mais de RASA1 , qui auraient pour effet de placer RasGAP dans l’incapacit´e de jouer son rˆole de catalyseur de la faible activit´e GTPase de Ras, et qui auraient la mˆeme cons´equence : l’activation quasi permanente de Ras et de sa voie de signalisation. De fa¸con assez surprenante, les mutations qu’ils ont identifi´ees se trouvent dans le domaine SH2 C-terminal et sont de simples mutations ponctuelles (L398R, G400K et V401I). Ils n’ont donc pas trouv´e de mutations au sein du domaine catalytique GAP. Ces r´esultats ont ´et´e corrobor´es par la suite, en montrant l’absence de mutations importantes de ce domaine GAP dans un grand nombre de tumeurs du poumon2 (Mitsudomi et al.,1994).
Souris knock-out RASA1-/- Henkemeyer et al.(1995) ont obtenu des souris RASA1-/-. Cette
mutation affecte notamment la capacit´e des cellules endoth´eliales `a d´evelopper un r´eseau vas- culaire complexe, et entraˆıne une importante mortalit´e neuronale. Ce mˆeme ph´enotype a ´et´e obtenu par transfection de cellules ES par un siRNA dirig´e contre l’ARNmde RasGAP (Kunath
et al.,2003).
Clonage et caract´erisation La prot´eine RasGAP a tout d’abord ´et´e identifi´ee comme une prot´eine cytosolique capable de catalyser l’activit´e GTPase de Ras (Trahey & McCormick,1987,
Gibbs et al.,1988).