4.6 Conclusion du chapitre 4
5.1.1 Description simplifi´ee
Aptam`ere peptidique : d´efinition
Un aptam`ere2 peptidique est une prot´eine poss´edant une boucle variable comportant un
petit nombre d’acides amin´es quelconques, et qui a ´et´e s´electionn´ee vis `a vis de son affinit´e pour une prot´eine donn´ee (Colas et al.,1996,Norman et al.,1999,Geyer & Brent,2000).
Le concept des aptam`eres peptidiques est donc relativement proche du concept d’anticorps, dans la mesure o`u la boucle variable d’un aptam`ere peut tout `a fait ˆetre compar´ee aux r´egions variables des anticorps. L’int´erˆet pr´esent´e par ce concept r´eside principalement dans la petite taille de l’aptam`ere peptidique et de sa r´egion variable, ainsi que dans la facilit´e de d´etermination
1. Aptanomics SA, M. Pierre Colas, Directeur Scientifique, 181-203, avenue Jean Jaur`es 69007 Lyon – FRANCE
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de la s´equence peptidique de cette r´egion variable (le s´equen¸cage d’un plasmide suffit). Hoppe-
Seyler et al.(2004) ont r´ecemment publi´e une revue pr´esentant les aspects th´eoriques et pratiques
de la mise en œuvre de la technique des aptam`eres peptidiques.
Le caract`ere combinatoire des aptam`eres peptidiques permet des cribles tr`es simples Ce concept se classe dans la cat´egorie des outils de biologie combinatoire. La principale dif- ficult´e, lorsque l’on r´ealise un crible de plusieurs millions de mol´ecules combinatoires diff´erentes, consiste `a obtenir l’identit´e du compos´e poss´edant la caract´eristique recherch´ee par le crible, et `a s’assurer que l’effet obtenu est bien dˆu `a ce compos´e (voir par exempleColas,2000). La maˆıtrise actuelle des techniques de manipulation de fragments d’ADN a permis de contourner dans une certaine mesure cette difficult´e. Il s’agit alors de concevoir des syst`emes de criblage permettant de ne pas dissocier le fragment d’ADN de la mol´ecule cribl´ee dont il porte l’identit´e. La plu- part des syst`emes imagin´es jusqu’`a pr´esent ne permet de cribler que deux types de mol´ecules : nucl´eotidiques (ARN ou ADN) ou prot´eiques (fragments ou prot´eines enti`eres). Cependant, de nouvelles id´ees commencent `a ´emerger, consistant par exemple `a utiliser `a la fois les outils de chimie combinatoire `a haut d´ebit et les technologies de puces `a ADN (la mol´ecule chimique porterait alors, directement greff´ee sur elle, un court oligonucl´eotide qui lui servirait de traceur,
Melkko et al.,2004).
Champ d’application de la technique des aptam`eres peptidiques
Le champ d’application des aptam`eres peptidiques est immense. De par la grande taille des banques qu’il est possible de cribler, parmi les diff´erents aptam`eres s´electionn´es, la probabilit´e d’obtenir des aptam`eres reconnaissant diff´eremment la prot´eine d’int´erˆet est tr`es importante. Les tests r´ealis´es ult´erieurement doivent permettre d’identifier les fonctions li´ees aux diff´erentes r´egions de la surface de la prot´eine cribl´ee.
Exemples d’utilisation de la technique des aptam`eres peptidiques
Inhibiteurs de la division cellulaire Les aptam`eres peptidiques ont tout d’abord ´et´e utilis´es pour identifier des ligands de Cdk2, dont certains ont une affinit´e nanomolaire et une activit´e in- hibitrice (Colas et al.,1996,Cohen et al.,1998). Toujours dans le cadre des prot´eines impliqu´ees dans la r´egulation du cycle cellulaire, Fabbrizio et al.(1999) ont identifi´e des aptam`eres pepti- diques inhibiteurs du facteur de transcription E2F1, dont certains, exprim´es dans des cellules en culture, poss`edent la capacit´e `a bloquer la division cellulaire en phase G1.
Inhibiteurs de voies de signalisation cellulaire Plusieurs ´equipes ont utilis´e la technique des aptam`eres peptidiques pour obtenir des inhibiteurs de la signalisation cellulaire. Ainsi,Xu & Luo (2002) ont obtenu des aptam`eres peptidiques reconnaissant sp´ecifiquement des formes mu- t´ees oncog´eniques de Ras (en utilisant le crible `a double appˆat,Xu et al.,1997), capables d’inhiber l’interaction Ras/Raf. De mˆeme, des inhibiteurs de Trio (prot´eine `a activit´e GEF – Guanidine Exchange Factor – pour Rho, Schmidt et al.,2002) et des inhibiteurs de EGFR (Buerger et al.,
2003) ont ´et´e identifi´es. Dans ce dernier exemple, certains des aptam`eres peptidiques poss`edent des activit´es cellulaires int´eressantes dans le cadre de la conception d’agents anti-tumoraux : inhibition de la phosphorylation de EGFR et de l’activation de Stat3 notamment.
Tr`es r´ecemment,Cui et al.(2005) ont utilis´e la plate-forme de pr´esentation Thior´edoxine pour contraindre et exprimer des fragments de prot´eines interagissant avec la prot´eine Smad de la voie
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de signalisation li´ee au facteur TGF-β, et ainsi ´etudier les interactions de ces diff´erents fragments. Ces travaux n’utilisent pas la capacit´e combinatoire des aptam`eres peptidiques qui nous int´eresse particuli`erement, mais seulement leur propri´et´e permettant de contraindre spatialement des peptides.
Inhibiteurs de prot´eines virales (HPV et HBV ) Butz et al. (2000) ont obtenu des inhibiteurs de la prot´eine E6 responsable de l’inhibition du suppresseur de tumeur p53 dans l’infection par certains HPV (papilloma virus). De mˆeme, Nauenburg et al. (2001) ont obtenu des inhibiteurs de la prot´eine E7 de ces mˆemes virus. Dans les deux cas, ces aptam`eres peptidiques provoquent l’apoptose de cellules infect´ees dans lesquelles ils sont exprim´es, et cette apoptose n’intervient pas dans des cellules non infect´ees.
Enfin,Butz et al.(2001) ont d´evelopp´e des aptam`eres peptidiques dirig´es contre la prot´eine de capside du virus de l’h´epatite B (HBV ), dont l’expression dans des cellules infect´ees r´eduit la capacit´e de r´eplication virale et d’assemblage de nouvelles capsides.
Technique de s´election : le crible double-hybride
La technique de s´election qui a ´et´e retenue par les inventeurs du concept d’aptam`eres pep- tidiques a d`es le d´ebut ´et´e un crible de type double-hybride3 en levure tout `a fait classique,
relativement proche du syst`eme con¸cu par Fields & Song (1989). Le syst`eme que nous avons mis en œuvre consiste donc `a exprimer, au moyen de plasmides transfect´es dans une levure, une prot´eine appel´ee « Appˆat » (fusion de la prot´eine d’int´erˆet, ici RasGAP-SH3, pour laquelle on souhaite obtenir des aptam`eres et du domaine de liaison `a l’ADN LexA, voir notamment
Brent & Ptashne,1985) et une seconde prot´eine, la « Proie » (fusion de la prot´eine plate-forme,
portant la r´egion variable, et du domaine d’activation de la transcription B42). Dans le sys- t`eme que nous avons utilis´e, la plate-forme de pr´esentation est constitu´ee par la Thioredoxine bact´erienne, enzyme dont le site actif est pr´ecis´ement remplac´e par la boucle variable de com- position s´electionn´ee par le crible. Les crit`eres de choix de cette plate-forme sont multiples : solubilit´e importante, compacit´e, taille relativement faible, structure parfaitement connue, et enfin, importantes contraintes structurelles sur les deux extr´emit´es de la boucle variable.
3. L’appellation double-hybride pour cette technique vient du fait qu’elle n´ecessite de transformer les levures avec deux plasmides diff´erents, exprimant deux prot´eines hybrides dont on va tester l’interaction. La description originale de ce syst`eme (appel´e alors « interaction trap » a ´et´e publi´ee parGyuris et al.(1993).
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100 Principe g´en´eral Boucle variable TrxA B42 AD Aptamere ProieRapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3 LexA BD Appat Pas d’interaction Pas d’expression Boucle variable TrxA B42 AD TrxA B42 AD Aptamere Proie
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3
LexA BD
Appat
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3 LexA BD SH3 LexA BD Appat Appat Pas d’interaction Pas d’expression (a) TrxA B42 AD
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3
LexA BD
TrxA B42 AD
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3
LexA BD
TrxA B42 AD TrxA B42 AD
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
Rapporteur (LEU, LacZ) Operateur LexA
Sequence reconnue par LexA BD
SH3
LexA BD
SH3
LexA BD
(b)
Fig. 5.1 – Principe du criblage en double hybride d’aptam`eres peptidiques. Au sein d’une mˆeme levure, trois plasmides sont introduits : deux servant `a l’expression des deux prot´eines hybrides « Appˆat » et « Proie », et le troisi`eme portant le g`ene rapporteur. (a) : lorsqu’il n’y a pas interaction entre la Proie et l’Appˆat, l’expression des rapporteurs n’est pas induite. (b) : en revanche, lorsqu’il y a interaction entre la Proie et l’Appˆat, l’expression est induite, et la levure peut donc ˆetre s´electionn´ee positivement (par sa survie sur un milieu d´epriv´e en Leucine ou par sa coloration bleue).