Comparaison avec d’autres techniques de biologie combinatoire

La technologie des aptam`eres peptidiques et leur crible par double hybride en levure per- mettent de r´ealiser tr`es rapidement, en « un seul tube » (one-pot) la s´election de quelques ´el´ements `a l’aide d’un test simple (par exemple : interaction avec une mol´ecule donn´ee), pr´esents au sein d’une banque tr`es large, et surtout de les identifier avec certitude tr`es rapidement apr`es le crible.

Les techniques dites de « crible `a haut d´ebit » de chimioth`eques (quelques milliers `a quelques centaines de milliers de produits diff´erents) se basent sur un principe tout autre : les diff´erents produits (constituant la banque `a cribler) sont plac´es un `a un dans des puits s´epar´es et identifi´es de centaines de plaques et le test est r´ep´et´e dans chaque puits. En effet, si on m´elangeait tous ces produits (en supposant que leurs effets soient ind´ependants et qu’ils ne r´eagissent pas entre eux), et que l’on r´ealisait le test dans « un seul tube », mˆeme si le test s’av´erait positif, il serait impossible de d´eterminer le produit responsable de cet effet4.

Les diff´erentes techniques pr´esent´ees ici reposent toutes sur l’utilisation d’un organisme vivant pour produire et amplifier `a la fois la mol´ecule `a tester et l’information permettant de l’identifier.

Aptam`eres ADN / ARN

La mol´ecule la plus simple actuellement `a identifier est bien sˆur l’ADN, dont le s´equen¸cage est une activit´e routini`ere de laboratoire. Il est donc tout `a fait logique d’avoir cherch´e dans un premier temps des mol´ecules d’ADN ou d’ARN dont la structure, apr`es repliement, permet d’obtenir une interaction avec une prot´eine cible5, et d’envisager d’utiliser cette s´equence d’ADN

4. Il semble cependant qu’Astexait d´evelopp´e une technologie permettant de r´ealiser ce type d’exp´erience, en identifiant par cristallographie le compos´e (parmi plusieurs) ins´er´e dans le site actif de la prot´eine dont on cherche des inhibiteurs (Tickle et al.,2004).

5. Deux essais cliniques de phase III sont en cours avec des ARN dirig´es contre VEGF et E2F (voir la revue de

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(ou ARN) en th´erapie « g´enique ».

De nombreuses exp´eriences de ce type ont ´et´e publi´ees. On peut notamment citer la d´ecou- verte d’aptam`eres ARN inhibiteurs de l’interaction Raf-1/Ras, inhibant la voie de signalisation li´ee aux prot´eines Ras (Kimoto et al.,2002).

La s´election des aptam`eres ARN se fait principalement in vitro, et en cela poss`ede certains avantages et d´efauts communs aux mol´ecules identifi´ees par phage display. La technique de s´elec- tion de ces aptam`eres nucl´eiques a ´et´e brevet´ee sous l’appellation SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, Gold & Tuerk,1993).

Phage display

La technique du phage display est sensiblement comparable `a celle du crible d’aptam`eres peptidiques par double hybride. Les bact´eriophages (ou phages) sont des virus rudimentaires infectant des bact´eries. La manipulation g´en´etique de ces phages ´etant maˆıtris´ee depuis un certain nombre d’ann´ees, et il est ainsi possible de faire exprimer `a la surface du phage une prot´eine g´en´etiquement modifi´ee.

Cette prot´eine chim´erique exprim´ee par le phage poss`ede un fragment de quelques acides amin´es expos´es al´eatoires. Les phages sont alors s´epar´es sur colonne d’affinit´e (compos´ee par exemple de billes S´epharose-glutathion charg´ees avec une prot´eine d’int´erˆet fusionn´ee `a la GST). Les phages n’exprimant pas une prot´eine reconnaissant cette prot´eine sont lav´es, et apr`es ´elution (par exemple avec un tampon de force ionique plus importante), les phages s´electionn´es sont amplifi´es par infection de bact´eries et soumis `a un nouveau cycle de s´election.

Le principal avantage de cette technique tient `a la taille des banques qu’il est possible de cribler et `a la facilit´e de mise en œuvre du crible. La g´en´etique des bact´eriophages permet en effet d’avoir des efficacit´es de transformation de la banque permettant d’obtenir jusqu’`a 1010/1011 clones ind´ependants (contre environ 108 pour les cribles en levure). De mˆeme il est possible, en r´ealisant plusieurs cycles de s´election/purification/amplification, d’enrichir significativement la population de phages en clones exprimant une prot´eine se fixant avec une tr`es grande affinit´e sur la prot´eine cribl´ee. De plus, la s´election in vitro permet tr`es facilement de rechercher des comp´etiteurs d’interactions, en ajoutant dans la suspension de phages diff´erentes mol´ecules dont on connaˆıt les caract´eristiques d’interaction avec la prot´eine cribl´ee.

Exemples d’utilisation du phage display Mori (2004) a r´ecemment publi´e une revue des diff´erentes recherches de ligands peptidiques par phage display ciblant des interactions prot´eine- prot´eine intervenant dans le processus tumoral (voir ´egalement Sidhu et al., 2003). On peut notamment citer par exemple les travaux deFerguson et al.(2004), qui ont r´ealis´e une recherche de ligands du domaine SH3 de la prot´eine Sem-5 (homologue chez C. elegans de Grb2) par phage display, et ont obtenu des peptides sensiblement ´equivalents aux peptides d´ej`a identifi´es pour leur interaction avec Grb2 (voir p. 68).

Anticorps th´erapeutiques s´electionn´es par phage display L’une des extensions les plus int´eressantes de la technique de phage display est certainement l’utilisation de banques compo- s´ees de fragments de g`enes codant pour les r´egions variables d’anticorps humains (scFv /Fab6, pour une revue : Kretzschmar & von R¨uden, 2002). Actuellement, plus de 30% des anticorps

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102 Mise en œuvre du crible double-hybride

monoclonaux en cours de d´eveloppement clinique ont ´et´e isol´es par cette technique, sans immu- nisation d’animaux. Les anticorps ainsi con¸cus sont enti`erement humains, et provoquent donc moins de r´eactions allergiques (voir par exemple le cas de l’anticorps α-TNFα, actuellement en

essai clinique dans le cadre du traitement de la polyarthrite rhumato¨ıde, Elliott et al.,1993).

Avantage du crible d’aptam`eres peptidiques en levure : interactions intracellulaires Caract´eristique commune `a la plupart des techniques de criblage in vitro, le phage display ne permet pas d’´ecarter des r´esultats du crible les peptides qui auraient une activit´e particuli`ere sur d’autres processus intracellulaires.

Au contraire, avec le crible double-hybride en levure, toutes les interactions ayant lieu dans le milieu intracellulaire, et de plus dans un organisme eucaryote relativement proche des cellules humaines, toute mol´ecule interf´erant avec le fonctionnement de la cellule peut rapidement ˆetre identifi´ee, soit lors du crible directement (mol´ecules cytotoxiques), soit dans la toute premi`ere phase de validation. En effet, nous cherchons `a identifier des mol´ecules inhibitrices de la pro- lif´eration cellulaire, mais par une interaction sp´ecifique avec une prot´eine donn´ee, et non par une simple toxicit´e cellulaire quelconque. Lors de la s´election d’aptam`eres par double-hybride, l’ensemble des exp´eriences permettent d’´eliminer toutes les mol´ecules qui auraient une telle toxi- cit´e non sp´ecifique : ces mol´ecules seraient automatiquement ´elimin´ees par leur toxicit´e pour les levures.