Ligands de domaines SH3

3.3.1 Ligands conventionnels

Les domaines SH3 interagissent conventionnellement avec des motifs de type h´elice polypro- line de type II (h´elice PPII, Zarrinpar et al.,2003). Une h´elice de ce type est une structure en h´elice tournant `a gauche, avec trois acides amin´es par tour et une allure g´en´erale ressemblant `

a un prisme `a base triangulaire. Ces h´elices sont structur´ees par la pr´esence en leur sein de plusieurs prolines, dont la substitution de l’azote induit une contrainte structurale importante favorisant la conformation en h´elice PPII(Creamer & Campbell, 2002). La figure 3.3 pr´esente sch´ematiquement les caract´eristiques de ces h´elices.

II

N C

C N

(a) Une h´elice PPII s’inscrit parfaitement dans un prisme `a base triangulaire.

CC_α N N N

X

_P

(b) Sur cette vue dans l’axe de l’h´elice, on note parfai- tement que les carbones β, ainsi que les substitutions des azotes de la chaˆıne principale jouent des rˆoles pr´e- pond´erants dans la conformation de l’h´elice et dans sa reconnaissance par un domaine SH3.

Fig. 3.3 – Structure sch´ematique des h´elices polyprolines de type II. D’apr`es (Zarrinpar et al., 2003)

Ligands de classe I et de classe II

Deux modes de reconnaissance de peptides riches en prolines ont ´et´e identifi´es :

– I : le peptide reconnu a son extr´emit´e N-terminale au niveau de la boucle RT-loop du SH3. Sa s´equence consensus est de type RxhPPhP3,

– II : le peptide reconnu a son extr´emit´e C-terminale au niveau de la boucle RT-loop du SH3. Sa s´equence consensus est de type PxhPxR.

Bien qu’un grand nombre de structures de domaines SH3 ait ´et´e r´esolu, en pr´esence ou non de leurs ligands, les d´eterminants essentiels de la reconnaissance de ligands de classe I ou de classe II ne sont pas encore parfaitement identifi´es. Certains domaines SH3 (comme par exemple le domaine SH3 de Fyn) reconnaissent des ligands de chacune des deux classes. En revanche, il semble que d’autres domaines ne reconnaissent que des ligands de classe II. Fernandez-Ballester

et al. (2004) ont propos´e comme explication `a cette sp´ecificit´e de reconnaissance des diff´erences

de conformation du tryptophane tr`es conserv´e (en position 43 dans notre num´erotation du SH3 de RasGAP). D’apr`es ces auteurs, l’acide amin´e en position 56, qui se trouve `a proximit´e directe du tryptophane, joue un rˆole particulier dans la stabilisation de la conformation de ce W43 : la

mutation de cet acide amin´e (Y132) dans la prot´eine Fyn en isoleucine abolit la reconnaissance

par Fyn de peptides de classe I, alors que la fixation de peptides de classe II reste possible.

Plate-forme de reconnaissance des domaines SH3 de Grb2

Sur les domaines SH3 de Grb2, dont les structures en pr´esence de ligands peptidiques riches en prolines ont ´et´e r´esolues, il a ´et´e tr`es nettement identifi´e une plate-forme de reconnaissance pour ces peptides. Cette plate-forme comporte des poches de reconnaissance de deux prolines et d’un acide amin´e basique (arginine souvent), suivant un motif consensus PxxPxR. De fa¸con assez int´eressante, suivant les prot´eines qui se fixent sur ces domaines SH3, ces motifs sont pr´esents soit dans le sens NH3-PxxPxR-COOH, soit dans le sens NH3-RxPxxP-COOH. La structure en

II

68 Ligands de domaines SH3

h´elice polyproline place les deux prolines des positions i et i + 3 d’un mˆeme cˆot´e de l’h´elice et leur permet d’entrer dans deux poches adjacentes `a la surface du domaine SH3 (sur la figure 3.4, ces deux poches sont not´ees S0 et S1).

Fig. 3.4 – Le domaine SH3 N-terminal de Grb2 complex´e par le peptide VPPPVPPRRR (Vidal

et al.,1998, PDB : 1AZE)

Affinit´e des peptides riches en prolines pour les domaines SH3

Les Kd de peptides riches en prolines pour des domaines SH3 ont ´et´e mesur´ees. Toutes ces

valeurs se trouvent dans la gamme 0,2–100 µM . Le tableau 3.1 pr´esente diff´erents r´esultats de mesures de Kd de peptides riches en prolines pour diff´erents domaines SH3.

Prot´eine `a SH3 Ligand Kd Ref.

Grb2 VPPPVPPRRR 2, 6 µM (N-term.) Cussac et al.(1994) 40 µM (C-term.)

Sem5 C-term YEVPPPVPPRRR 28 µM Lim et al. (1994a)

Abl APTYSPPPPP 0, 4 µM Pisabarro & Serrano(1996)

PPAYPPPPVP 5 µM Viguera et al.(1994)

PI3K RKLPPRPRR 7, 6 µM Chen et al.(1993)

Src SFRPLPPLPQFLPMY 185 µM Cheadle et al.(1994)

KGGGAAPPLPPRNRPRL 0, 24 µM Rickles et al. (1995)

Crk N-term PPPALPPKKR 1, 89 µM Knudsen et al. (1995)

Tab. 3.1 – Affinit´es de diff´erents peptides riches en prolines pour des domaines SH3.Voir ´egale- mentYu et al.(1994),Lim et al.(1994b),Alexandropoulos et al.(1995),Wittekind et al.(1994)

II

Dim`ere de peptides `a forte affinit´e

La d´etermination de la structure compl`ete de la prot´eine Grb2, et en particulier des posi- tions relatives de ses deux domaines SH3 a permis la conception par mod´elisation mol´eculaire d’une mol´ecule se fixant simultan´ement sur ces deux domaines, constitu´ee du dim`ere des pep- tides VPPPVPPRRR reli´e par un espaceur. Alors que chacun des deux peptides ne poss`ede qu’une affinit´e de 2, 6 et 40 µM (respectivement pour les domaines N-ter et C-ter), le dim`ere a pour la prot´eine enti`ere une affinit´e de 40 nM (Cussac et al.,1999) et poss`ede une activit´e anti-tumorale sur diff´erents mod`eles tumoraux : in vitro (Garbay & Roques, 1999) et in vivo sur tumeurs x´enogreff´ees sur souris nude, en synergie avec le docetaxel (Taxot`ere➤,Gril et al.,2004). La mo- dification de certains r´esidus de ce « peptidim`ere », en les rempla¸cant par des acides α-amin´es N-alkyl´es a mˆeme permis d’augmenter consid´erablement l’affinit´e de ces mol´ecules (Vidal et al.,

2004).

Un second site de reconnaissance sur le domaine SH3 N-ter de Grb2

Vidal et al.(1998) ont montr´e que les acides amin´es 36 `a 45 du domaine SH3 N-terminal de

Grb2 constituaient un second site de liaison avec certains de ses ligands, en compl´ement de la conventionnelle plate-forme de reconnaissance des peptides riches en prolines.

En effet, la prot´eine Sos poss`ede une forte affinit´e pour Grb2 (de l’ordre de quelques dizaines de nanomolaire), acquise grˆace `a une reconnaissance simultan´ee des deux domaines SH3 de Grb2 (l’interaction entre Sos et un seul domaine SH3 de Grb2 est bien moins forte). En revanche, la prot´eine Dynamine interagit de fa¸con bien plus forte avec un seul domaine SH3 de Grb2, et cette meilleure affinit´e est due `a l’utilisation de ce second site de fixation, qui compl`ete la plate-forme conventionnelle commune `a Sos et Dynamine.

Cette propri´et´e de ce domaine SH3 semble ˆetre partag´ee avec des domaines SH3 d’autres prot´eines, notamment Src (Schumacher et al.,1996) ou Vav (Romero et al.,1996).

3.3.2 Ligands non conventionnels

Un certain nombre de domaines SH3 reconnaissent des ligands n’appartenant pas aux classes mentionn´ees ci-dessus. Le tableau 3.2 pr´esente diff´erents domaines SH3 qui ont ´et´e identifi´es `

a ce jour comme reconnaissant des peptides ne suivant pas la s´equence consensus PxxP. La comparaison des s´equences de ces domaines avec celle de RasGAP n’apporte pas d’informations convenables pour la d´efinition de nouveaux motifs de reconnaissance pour cette prot´eine qui nous int´eresse particuli`erement.

Mˆeme s’il en avait ´et´e autrement et par exemple s’il avait ´et´e possible d’obtenir par ces ali- gnements de s´equences (entre le domaine SH3 de RasGAP et d’autres domaines SH3 non conven- tionnels dont des ligands peptidiques sont connus) une premi`ere id´ee d’une s´equence consensus de peptides inhibiteurs de RasGAP-SH3, la relative impr´ecision des donn´ees structurales dispo- nibles ne permettrait pas de mener des calculs de mod´elisation mol´eculaire suffisamment pr´ecis pour la conception de peptides interagissant avec RasGAP-SH3.

II

70 Conception d’inhibiteurs de domaines SH3

SH3 Ligand Motif Ref

Fyn SKAP55 RKxxYxxY Kang et al. (2000)

Vav Ku-70 ? Romero et al. (1996)

Pex13p Pex5p WxxQF Barnett et al.(2000)

Eps8 synthetic (phage display) PxxDY Mongiov´ı et al.(1999)

Gads SLP-76 RxxK Liu et al.(2003)

Hrs-BP UBPY Px(V/I)(D/N)RxxKP Kato et al.(2000)

Tab.3.2 – Domaines SH3 non conventionnels et motifs de reconnaissance propos´es