5.2 Mise en œuvre du crible double-hybride
5.2.3 Description du d´eroulement du crible
Les paragraphes suivants d´etaillent la d´ecouverte du premier aptam`ere obtenu (RG 01). Ces ´etapes ont ´et´e reproduites pour chacun des autres aptam`eres dont nous ne pr´esentons ensuite que les derni`eres phases de validation.
Protocole de criblage
Le protocole de criblage que nous avons utilis´e comporte les tˆaches suivantes :
1. Transformation de la banque d’aptam`eres dans la souche EGY191α, et cong´elation d’aliquots de ces levures transform´ees,
2. D´econg´elation d’un aliquot de la banque transform´ee, v´erification de la qualit´e de la trans- formation,
3. Transformation du vecteur Appˆat pEG-202 RasGAP-SH3 et du Rapporteur pSH18-34 dans la souche EGY42a,
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4. D´econg´elation de la banque transform´ee et conjugaison avec les levures contenant l’Appˆat et le Rapporteur,
5. ´Etalement sur milieu s´electif (milieu minimum SD Selective Dropout Medium) : – contenant du Galactose (pour induire l’expression des aptam`eres-proies),
– ne contenant ni Uracile, Histidine et Tryptophane (pour le maintien des trois plasmides), – ne contenant pas de Leucine (pour la s´election des levures exprimant un aptam`ere in-
teragissant avec l’appˆat),
6. `A partir de 48h apr`es l’´etalement des diplo¨ıdes, des colonies apparaissent sur ce milieu s´electif. Ces colonies sont recueillies et streak´ees (´etal´ees sous forme de petits bˆatonnets) sur milieu SD U−/H−/W− (pour la conservation des plasmides),
7. 24h apr`es r´ecup´eration des colonies positives, les levures sont r´epliqu´ees sur quatre milieux diff´erents pour une premi`ere v´erification du ph´enotype double-hybride en utilisant les deux syst`emes de rapporteur :
– r´etablissement du caract`ere prototrophique vis `a vis de la Leucine (milieux SD U−/-
H−/W−/L−, Glucose ou Galactose),
– visualisation de l’expression de la β-galactosidase par apparition d’une coloration bleue lorsque le milieu de culture contient de l’X-Gal(milieux SD U−/H−/W−/ X-Gal, Glu-
cose ou Galactose)
8. R´ecup´eration des r´egions variables des aptam`eres poss´edant un ph´enotype double-hybride net dans le test pr´ec´edent. Cette r´ecup´eration se fait soit :
– par r´ecup´eration des plasmides (transformation dans des bact´eries apr`es lyse des levures, miniprep. . . ),
– par PCR (amplification des r´egions variables) et recombinaison homologue en levure pour la reconstitution du plasmide,
9. Reconfirmation par retransformation des aptam`eres et derni`ere v´erification du ph´eno- type double-hybride,
10. Extraction des plasmides et s´equen¸cage de la r´egion variable,
11. ´Etudes de sp´ecificit´e : v´erification que l’aptam`ere interagit bien sp´ecifiquement avec le domaine SH3 et non directement avec l’op´erateur LexAopou avec le domaine d’interaction
avec l’ADN LexA.
Nous avons d´elib´er´ement choisi de d´etailler seulement les exp´eriences qui nous ont permis d’isoler le premier aptam`ere dirig´e contre le domaine SH3 de RasGAP. L’obtention des aptam`eres suivants s’est faite de fa¸con tout `a fait similaire, en renouvelant les ´etapes d´ecrites, et en optimisant certains param`etres.
Premi`ere v´erification du ph´enotype double-hybride
La figure 5.11 pr´esente la premi`ere ´etape de v´erification du ph´enotype de double-hybride. Environ 850 clones positifs (parmi les 107 `a 108 transformants cribl´es) issus de la s´election sur milieu sans Leucine sont isol´es et streak´es sur une boˆıte originale, qui est ensuite r´epliqu´ee sur les quatre milieux de visualisation du ph´enotype double-hybride. Cette ´etape a pour objectif d’´eliminer les clones dont le ph´enotype « survie sur milieu sans Leucine » ne provient pas de l’interaction entre les prot´eines Proie et Appˆat. En effet, le stress induit sur les levures par leur ´etalement sur un milieu ne permettant pas a priori leur survie, cr´ee une forte pression de s´election pouvant stimuler la restauration de la prototrophie vis `a vis de la Leucine.
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Le ph´enotype double-hybride que l’on cherche donc `a v´erifier doit avoir les caract´eris- tiques suivantes :
- SD U− H− W− X-Gal Glucose absence de coloration bleue
- SD U− H− W− X-Gal Galactose forte coloration bleue - SD U− H− W− L− Glucose absence de croissance
- SD U− H− W− L− Galactose croissance (levures blanches)
Fig. 5.11 – V´erification du ph´enotype double hybride apr`es r´ecup´eration de clones positifs.Sur chacune des boˆıtes, des contrˆoles positifs et n´egatifs d’interaction sont pr´esent´es (respectivement `a gauche et `a droite des boˆıtes). Les clones sur ces boˆıtes sont num´erot´es de 609 `a 640, de gauche `a droite et de haut en bas.
Sur la figure 5.11, on montre que seul l’aptam`ere no618 poss`ede un ph´enotype double-hybride parfait. De nombreux autres clones pr´esentent une faible expression de la β-galactosidase, et surtout ont une survie sur Leucine ind´ependante de l’expression de leur aptam`ere conditionn´ee par la pr´esence de Galactose dans le milieu de culture.
Les colonies poss´edant ce type de ph´enotype double-hybride sont r´ecup´er´ees pour analyser plus en d´etail les aptam`eres exprim´es.
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Extraction des fragments codant pour les r´egions variables et reconstruction des vecteurs exprimant les aptam`eres
L’´etape suivante consiste `a v´erifier si ce ph´enotype double-hybride est reproductible `a partir de la s´equence nucl´eotidique codant pour les aptam`eres exprim´es dans ces colonies. Pour cela nous avons utilis´e principalement13l’amplification par PCR de la r´egion variable directement `a partir de levures enti`eres. Apr`es amplification, ces produits de PCR sont analys´es par ´electropho- r`ese. La figure 5.12 pr´esente le r´esultat de ce type d’amplification. On note que sur cette figure, les fragments amplifi´es n’ont pas tous la mˆeme longueur : il s’agit ici d’aptam`eres issus d’un crible utilisant la banque de premi`ere g´en´eration, dont les r´egions variables ont une longueur th´eorique de 16 acides amin´es, mais en pratique souvent beaucoup plus longue.
(a)
(b)
Fig.5.12 – D´epˆot des produits de PCR obtenus `a partir des aptam`eres isol´es au cours du crible.
Le vecteur pJM-1 contenant un aptam`ere quelconque avec une r´egion variable de 16 acides amin´es est utilis´e comme contrˆole positif et de marqueur de taille (b, derni`ere colonne). Les PCR dont les produits sont pr´esent´ees sur les figures (a) et (b) ont ´et´e r´ealis´ees avec deux couples d’oligonucl´eotides diff´erents. Les longueurs des fragments amplifi´es qui comportent, en plus de la r´egion variable, une partie de la Thior´edoxine TrxA, sont donc logiquement diff´erentes. Gel d’agarose/TBE 2%, marqueurs de taille de 100 bp DNA ladder.
La figure 5.13(b) pr´esente les r´esultats de transformation de levures EGY191α pour la re- constitution des vecteurs d’expression des aptam`eres par recombinaison homologue (voir figure 5.13(a)). Dans chacun des puits de cette plaque standard `a douze puits, nous avons transform´e des levures « fraˆıches » avec le plasmide pJM-1 vide et ouvert par digestion (qui ne peut donc se
13. Dans certains autres cas, nous avons lys´e les levures pour r´ecup´erer le contenu plasmidique, et amplifi´e ces plasmides en bact´eries.
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maintenir dans les levures) au niveau du site d’insertion des r´egions variables, et avec les frag- ments des aptam`eres amplifi´es par PCR (obtenus sur la figure 5.12). Les levures qui survivent sur le milieu de culture d´epriv´e en Tryptophane sont donc celles qui portent un vecteur pJM-1 referm´e par recombinaison homologue du fragment amplifi´e par PCR. Cette technique permet en effet la construction de plasmides tr`es ais´ement et tr`es pr´ecis´ement au sein mˆeme de la levure
(Oldenburg et al.,1997). TrxA CGP GPC B42 AD TrxA CGP VR GPC CGP VR GPC PCR fragment pJM-1 vector
(a) Principe de la recombinaison homologue : la co-transformation dans les levures du vecteur ouvert (et qui donc ne peut se maintenir en l’´etat) et du fragment amplifi´e par PCR va conduire `a la s´election sur milieu ad´equat des levures poss´edant le plasmide referm´e avec la r´egion variable (VR).
(b) Dans chaque puits, des colonies porteuses du vecteur reconstitu´e par recombinaison homologue apparaissent.
Fig. 5.13 – Reconstitution des aptam`eres pour reconfirmation ou recombinaison homologue `a partir des fragments amplifi´es par PCR.Le puits not´e C et comptant un tr`es faible nombre de colonies correspond au contrˆole o`u seul le plasmide vide ouvert est transfect´e. Les puits no605 et 618 semblent ne
pas contenir de colonies, mais en fait, se trouvant au centre de la boˆıte, leur milieu de culture reste tr`es humide et les colonies fusionnent rapidement par dispersion dans des gouttelettes.
Cette ´etape d’extraction des r´egions variables et de r´einsertion dans un vecteur « propre » permet de s’affranchir de toutes les modifications qui ont pu avoir lieu dans les levures lors de la phase initiale du crible et ainsi d’´ecarter certains faux positifs.
Reconfirmation des aptam`eres apr`es reconstitution des vecteurs
La figure 5.14 pr´esente les r´esultats des ´evaluations des interactions entre ces aptam`eres reconstitu´es par recombinaison homologue et le domaine SH3 de RasGAP.
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Fig. 5.14 – Reconfirmation des aptam`eres obtenus dans le premier crible : levures EGY191α × EGY42a, rapporteur pSH18-34, appˆat pEG202 RasGAP-SH3.
La lecture de cette figure laisse apparaˆıtre que seules les interactions avec le domaine SH3 de RasGAP des aptam`eres 347, 618 et 825 sont effectivement reconfirm´ees en double-hybride.
V´erification de la sp´ecificit´e de l’interaction
La figure 5.15 pr´esente le premier test de v´erification de la sp´ecificit´e de l’interaction entre ces aptam`eres et l’appˆat RasGAP-SH3. Pour cela, nous avons utilis´e une matrice d’interaction pour comparer les interactions entre diff´erents aptam`eres (Proies) et diff´erents Appˆats. Les Appˆats transform´es dans des levures EGY42a (avec le vecteur rapporteur pSH18-34) sont ´etal´es sous forme de lignes, et conjugu´es avec des levures transform´ees par les diff´erentes proies. A chaque intersection ligne/colonne, les diplo¨ıdes form´es sont s´electionn´es par un milieu de culture ad´equat (s´electionnant les triples transformants). Cette technique de matrices permet donc de tester tr`es rapidement les interactions entre plusieurs prot´eines.
Sur la figure 5.15, les aptam`eres no618, 825 et 831 et Aurora-B, une cible de RasGAP-SH3
trouv´ee par double hybride, ont ´et´e test´es pour leur interaction avec quatre appˆats (en fin de ligne, la notation adopt´ee dans cette figure) :
– pEG202 RasGAP-SH3 (l’appˆat utilis´e pour le crible) SH3
– pEG202 RasGAP-SH3W317K SH3W317K
(mutant du domaine SH3, au niveau du Tryptophane 317 tr`es conserv´e)
– pEG202 Nck (prot´eine contenant ´egalement un domaine SH3) Nck
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Fig. 5.15 – Premi`ere v´erification de la sp´ecificit´e des aptam`eres 618, 825 et 831.L’aptam`ere not´e 10M reconnaˆıt sp´ecifiquement cdk2. Aur-B d´esigne Aurora-B (ins´er´ee dans le vecteur pJG4-5).
Le r´esultat de cette premi`ere v´erification de la sp´ecificit´e a donc permis d’´etablir que les aptam`eres 618 et 825 interagissent sp´ecifiquement avec le domaine SH3 de RasGAP.