Optimisation du protocole de préparation de la suspension cellulaire

2.1. Différents protocoles de préparation étudiés

2.1.1. Décollement des cellules

Pour cette étude, nous avons utilisé des cellules CHO, qui feront l'objet de tous les travaux de ce chapitre. Le tapis cellulaire dans la flasque de culture est tout d'abord rincé deux fois au PBS. On laisse ensuite agir l'enzyme de décollement, la trypsine ou l'accutase pendant 3 minutes à 37°C. L'action de l'enzyme est alors inhibée par du milieu de culture pour la trypsine (inhibition par le Sérum Fœtal de Veau présent dans le milieu de culture) et par du PBS pour l'accutase. Les cellules sont ensuite resuspendues dans du PBS. La viabilité des cellules dans la suspension est alors calculée, par la technique de révélation du bleu de Trypan (un marqueur de la mortalité cellulaire).

2.1.2. Dissociation des cellules

Nous avons sélectionné deux traitements pour dissocier les cellules encore en amas après l'étape de décollement. Le premier est un traitement chimique et consiste en l'ajout de 10% d’accumax dans la solution de PBS, contenant les cellules, pendant 5 minutes. Les cellules sont ensuite resuspendues à une concentration de 1 million par mL dans du milieu électrophysiologique.

Le deuxième est une méthode physique par l'utilisation d'un tamis cellulaire (avec des mailles de 70 µm) qui permet de filtrer la suspension cellulaire et de retenir les amas de cellules. Dans ce cas, la suspension cellulaire est tout d'abord resuspendue dans du milieu électrophysiogique à la bonne concentration (1 million par mL), puis filtrée.

Le pourcentage d'amas cellulaires dans la suspension est ensuite calculé dans des « cellules de Malassez » pour chaque protocole.

2.1.3. Etude cinétique

Comme nous l'avons vu, nous souhaitons conserver les cellules, en tube Eppendorf de 1 mL ou 0,5 mL, pendant 2 à 3 heures, temps nécessaire pour tester les neuf microtrous d'une puce. Le maintien de cellules dissociées en suspension impose une agitation. Des tests préliminaires menés au laboratoire ont révélé que le carrousel est le mode d’agitation le plus efficace et le

plus respectueux de la viabilité cellulaire. Au cours de cette étude sur des suspensions cellulaires maintenues sous agitation avec un carrousel, la viabilité cellulaire ainsi que le pourcentage d'amas sont déterminés à des temps compris entre 0 et 4h30.

2.2. Résultats

Le Tableau 6 présente l'évolution de la viabilité cellulaire dans la suspension en fonction du protocole de préparation et du temps. Nous remarquons tout d'abord que la trypsine permet de décoller le tapis cellulaire avec une meilleure viabilité que l'accutase. De plus, on constate que pour les protocoles où l'accumax est utilisé, la viabilité diminue d'au moins 40% après 1h30 de conservation alors qu'avec l'utilisation du tamis cellulaire elle ne chute que de 5%. Pendant les 4h30 de cinétique, la viabilité cellulaire est relativement stable. Ainsi la meilleure viabilité cellulaire (90%) est obtenue lorsque les cellules sont d'abord décollées à l'aide de la trypsine puis filtrées sur tamis cellulaires. La deuxième méthode qui pourrait convenir, mais avec un viabilité inférieure (70%), est le décollement du tapis cellulaire avec l'accutase puis la filtration de la suspension sur tamis. Pour l'étude du nombre d'amas cellulaires nous ne retiendrons donc que ces deux méthodes.

Enzyme de décollement Accutase Trypsine

Méthode de dissociation des

amas Accumax

Tamis

cellulaire Accumax

Tamis cellulaire

% de viabilité avant traitement

de dissociation t = 0h 75 % 95 % % de viabilité t = 1h30 35% 70% 40% 90% % de viabilité t = 2h30 25% 70% 40% 90% % de viabilité t = 4h30 25% 70% 35% 90%

Tableau 6: viabilité cellulaire dans la suspension en fonction de la méthode de préparation cellulaire et du temps de conservation. Deux enzymes de décollement sont testées ainsi que deux méthodes de dissociation des amas cellulaires. Les pourcentages de viabilité sont donnés à ± 5%, l'erreur dépendant de la variabilité cellulaire et de la méthode de comptage manuelle.

Le Tableau 7 présente le deuxième paramètre déterminant de cette étude, le pourcentage d'amas cellulaires. Dès le décollement, l'accutase permet une meilleure dissociation des cellules, avec seulement 1% d'amas de cellule dans la suspension contre 7% avec la trypsine. On remarque que dans les deux cas ce pourcentage devient nul après la filtration sur tamis cellulaire. Le décollement du tapis cellulaire à l'accutase, suivi de la filtration, permet de conserver une suspension cellulaire sans amas durant 4h. Lors de l'utilisation de la trypsine, le pourcentage d'amas cellulaires (amas de deux cellules) augmente légèrement pour atteindre 4% au bout de 4 h d'agitation.

Protocole Accutase + tamis Trypsine + tamis % d'amas cellulaires avant filtration 1% 6.5% % d'amas cellulaires après filtration t = 0h 0% 0% % d'amas cellulaires t = 2h 0% 2% * % d'amas cellulaires t = 4h 0% 4% *

Tableau 7: détermination du pourcentage d'amas cellulaires dans la suspension avant filtration sur tamis puis au cours du temps. Les cellules conservées en tube Eppendorf sont agitées avec un carrousel. (*: amas

constitués de 2 cellules)

3. Discussion

Les différents protocoles testés sur des cellules CHO permettent de mettre en évidence les effets néfastes de l'accutase sur la viabilité cellulaire, bien que son fabriquant d’une part, et certaines études d’autre part, la reportent comme une des enzymes les plus « douces » pour les cellules (cf chapitre 2). Cependant l’utilisation de cette enzyme permet d’obtenir des pourcentages d’amas cellulaires nuls dans la suspension pendant plusieurs heures sous agitation. La méthode de dissociation des amas semble également être déterminante pour la viabilité, puisque l’accumax se révèle plus nocif que la dissociation mécanique par tamis cellulaire.

Aucun protocole testé ne permet d’obtenir une viabilité cellulaire maximale et un pourcentage d’amas minimal, mais l’utilisation de la trypsine pour le décollement du tapis cellulaire, suivie de la filtration sur tamis semble constituer un bon compromis. Avec ce protocole, la viabilité est maximale et le nombre d’agrégats reste très faible et acceptable durant les deux ou trois premières heures de conservation. Privilégiant la viabilité cellulaire par rapport à la formation d’agrégats, nous avons choisi ce protocole comme protocole de préparation de la suspension cellulaire pour la suite des tests décrits dans ce chapitre.