Assemblage et poste de mesure

3.1. Description des différents éléments assemblés

Mon travail a consisté à concevoir un assemblage simple de plusieurs modules et à valider chaque étape de l’assemblage pour, au final, mettre au point un protocole complet de mesure de patch-clamp planaire.

Le microsystème que j’ai développé permet :

• de tester des puces différentes sans jamais modifier les divers modules de l’assemblage, • de dispenser les fluides de part et d’autre de la puce, afin d’avoir accès aux deux faces de la

cellule,

• de mesurer les courants ioniques par l’intérmédiaire d’électrodes Ag/AgCl,

• de synchroniser la mesure électrique avec la dispense des fluides, pour étudier des canaux chemo-sensibles,

• de tester des cellules de taille différente allant des cellules de mammifères de 10 à 20 µm de diamètre aux ovocytes de Xénope de 800 µm de diamètre environ,

• d’utiliser les amplificateurs commerciaux de patch-clamp existant dans les laboratoires. Les 9 microtrous de la puce disposée dans l’assemblage forment ainsi 9 sites de mesures indépendants électriquement et fluidiquement [95, 98].

Cet assemblage est composé de plusieurs modules (Figure 25 et Figure 26) :

• un circuit imprimé : il comporte 9 électrodes d’argent, disposées en vis à vis des microtrous sur la puce silicium. Chacune de ces électrodes circulaires est percée de 2 orifices de 400 µm de diamètre, qui permettent d’insérer et de coller des capillaires pour faire circuler les fluides dans la partie inférieure du site de mesure.

• des joints toriques : placés de part et d’autre de la puce, ils définissent une fois pressés ce que l’on nommera les chambres fluidiques supérieure et inférieure. Ces joints sont fabriqués en nitrile, matériau reconnu pour sa très grande résistance chimique et sa faible adsorption de substances. Nous avons vu en effet dans la partie B.3.3 du chapitre 1 concernant les verrous technologiques inhérents à la technique du patch-clamp planaire que l’adsorption des molécules hydrophobes était un problème majeur ; par l’utilisation de ce matériau nous espérons limiter ce problème. De plus, grâce à sa grande dureté (~ 70 Shore A), le nitrile est

Figure 25 : Etapes d’assemblage du système.

1 : le circuit imprimé inférieur, constitué des 9 électrodes Ag/AgCl, est disposé sur la mâchoire inférieure en forme de U. Chaque électrode est traversée par 2 capillaires pour la dispense des fluides.

2 : une grille plastique permet de répartir les 9 joints toriques.

3 : la puce en silicium est positionnée dans la partie de la grille plastique prévue à cet effet. 4 : une nouvelle grille plastique permet de disposer les joints de l’étage supérieur.

5 : une fois le capot supérieur placé, la partie supérieure de la mâchoire permet de presser l’assemblage.

6 : les électrodes du site de mesure souhaité sont connectées au préamplificateur : au moyen d’un connecteur en Téflon pour l’électrode de mesure et à l’aide d’un fil pour l’électrode de référence (masse).

un polymère dont la déformation est parfaitement contrôlée et limitée lors de l’écrasement. Ainsi à l’assemblage le serrage est reproductible et réalisé sans contrôle puisque les joints ne se déforment qu’au maximum de 10%.

• des grilles de positionnement en plastique: d’une épaisseur inférieure à celle des joints (dans leur état écrasé), ces grilles sont placées de part et d’autre de la puce et permettent un positionnement aisé des joints au niveau des 9 sites de mesure. La grille de l’étage inférieur possède également des ergots qui guident le positionnement de la puce lors du montage. • un capot supérieur : ce capot peut-être soit un circuit imprimé similaire à celui de l’étage

inférieur, soit une grille plastique. Dans le premier cas, l’assemblage est totalement symétrique par rapport à la puce, mais l'opacité du circuit imprimé et la présence des capillaires empêchent toute observation du site de mesure sous un microscope. Avec la deuxième option que j’ai utilisée tout au long de ma thèse, la grille plastique permet de presser les joints supérieurs tout en laissant un accès visuel et physique au microtrou. La chambre fluidique supérieure ainsi créée est totalement ouverte et un filament d’argent chloruré joue le rôle de l’électrode de référence (à la masse).

Figure 26 : schéma représentant une coupe du système au niveau d’un des neuf sites de mesure.

Tous les éléments constituant l’assemblage sont réutilisables à chaque montage, après avoir été soigneusement nettoyés. Les électrodes d’argent doivent être régulièrement chlorurées avec de l’eau de javel pure (1 ou 2 fois par semaine suivant la fréquence des expériences).

3.2. Connexion fluidique

Les solutions électrophysiologiques sont dispensées dans les chambres fluidiques grâce à des capillaires traversant le circuit imprimé au niveau des électrodes. Chaque chambre de mesure est équipée de deux capillaires, un d’entrée et un de sortie. Ces capillaires en silice, de 250 µm et de 360 µm de diamètre intérieur et extérieur respectivement, sont directement collés au circuit imprimé avec une colle activée par rayons ultraviolets. Les fluides sont dispensés avec des seringues par l’intermédiaire de capillaires en Téflon de 300 µm de diamètre interne connectés et collés à ceux en silice.

Notons que le choix du matériau des capillaires a été fait de manière à s’affranchir au maximum des problèmes d’adsorption de molécules hydrophobes.

3.3. Connexion électrique

La mesure des courants ioniques est assurée par les électrodes Ag/AgCl déposées sur le circuit imprimé (Figure 26). Ces électrodes sont réutilisables, comme le circuit imprimé, et possèdent une grande stabilité mécanique grâce au protocole de fabrication suivi : les électrodes sont d’abord collées à chaud avec un film de cuivre ; après une attaque chimique afin de créer une porosité dans le métal, un dépôt de 40 µm de cuivre est réalisé par électrolyse ; enfin, après une nouvelle attaque chimique similaire à la première, une épaisseur de 1 à 2 µm d’argent électrolytique est déposée. Ce procédé nous a permis d’obtenir des électrodes stables pouvant être chlorurées à de très nombreuses reprises. Typiquement, les électrodes ne se dégradent pas avant une durée de 6 mois d’expériences intensives. Les électrodes sont reliées par les pistes à des broches sur le bord du circuit imprimé.

La connexion du circuit imprimé à la tête d’amplification de l’amplificateur commercial a constitué une étape plus délicate. L’étage supérieur possède les électrodes de référence (à la masse) et n’est donc pas sensible aux perturbations électriques causées par une mauvaise connexion ; nous relions donc cette électrode et la tête d’amplification par un fil électrique classique. Par contre, la connexion des électrodes de mesure est plus critique : le connecteur doit être rigide, car toute vibration générerait du bruit dans la mesure. De plus, il doit être isolé du milieu environnant de manière à ne pas constituer une antenne captant les perturbations extérieures en particulier le 50 Hz. A l’instar du holder (pièce qui permet de maintenir la pipette et de la relier à l’étage d’amplification) utilisé en patch-clamp conventionnel, le matériau employé doit être peu bruiteux et inerte, et est souvent choisi empiriquement [54, 55]. Les holders sont la plupart du temps fabriqués en Polycarbonate ou en Teflon, matériaux possédant une très faible dissipation diélectrique. Nous avons donc conçu une pièce en Teflon de 4 cm de long et de 1 cm de diamètre, dans laquelle est tendu un fil électrique (Figure 25, étape 6).

Figure 27 : photo du poste de patch-clamp planaire du laboratoire Biopuces.

3.4. Poste de mesure

L’assemblage est placé dans une cage de Faraday et sous un stéréo-microscope droit pour permettre la visualisation des cellules lors de la phase de positionnement par aspiration (Figure 27).