Parallèlement à la caractérisation des slow potentials, la question se posait s’il était possible d’utiliser l’enregistrement de l’activité des îlots par MEA pour le phénotypage élec-trophysiologique d’îlots de souris invalidées pour des gènes d’intérêt. Dans cette optique, nous avons mis en place une collaboration avec le groupe du Dr. Christophe Mulle (Physiolo-gie des synapses glutamatergiques, Institut des Maladies Neurodégénérative, UMR CNRS 5297), spécialisé dans les mécanismes de la transmission synaptique glutamatergique, et pos-sédant une large collection de souris transgéniques.
Les cellules β des îlots de Langerhans sont des cellules endocrines qui possèdent de nombreuses similitudes avec les cellules neuronales, comme par exemple l’expression des protéines SNARE nécessaires à l’exocytose (Sudhof & Rothman 2009, Sudhof 2013), les pro-téines d’adhésion synaptique comme la neuroligine et la neurexine (Suckow et al. 2008, Mosedale et al. 2012, Zhang et al. 2013), ou encore de la latrophiline, le récepteur de l’α-latrotoxine (Lang et al. 1998, Sudhof 2001). De même, de nombreux récepteurs aux neuro-transmetteurs sont retrouvés dans les îlots (Satin & Kinard 1998).
Nous avons donc étudié en détail la liste des souris transgéniques disponibles et, suite à une recherche bibliographique, notre choix s’est porté sur les souris invalidées pour la neu-roligine 1 (NL1) ou les récepteurs ionotropiques au glutamate de type kaïnate 2 (GluK2) ou 3 (GluK3). En effet, il a été montré que ces différentes protéines sont exprimées dans les îlots de Langerhans, cependant leur fonction précise reste peu ou pas connue.
Les expériences préliminaires menées sur les îlots de souris invalidées pour la NL1 n’ont pas montré de résultats significativement différents par rapport aux îlots de souris con-trôles. Les expériences comparant la sensibilité au glucose des slow potentials dans les îlots de souris invalidées pour GluK3 et dans les îlots de souris sauvages n’ont pas non plus révélé de différences entre les deux génotypes. Nous avons donc décidé de concentrer nos expé-riences sur les animaux invalidés pour GluK2.
SECONDE ÉTUDE
Fig 1 : Expression de la sous-unité GluK2 dans les îlots de Langerhans
A et B: Clichés confocaux de sections de pancréas de rat montrant des îlots marqués pour A: les récep-teurs GluK2/3 et l’insuline; B: les réceprécep-teurs GluK2/3 et le glucagon; encadré: les réceprécep-teurs GluK2/3 et la somatostatine. Les récepteurs glutamatergiques sont marqués en rouge et les hormones en vert.
C: Profil d’expression de la sous-unité GluK2 dans les tissus pancréatiques établi à partir d’études mi-cro array (T1Dbase). D: Analyse RT-PCR de l’expression des ARNm de la sous-unité GluK2 (GluR6) dans les tissus cérébraux de rat (1), la lignée clonale de cellules insulinosécrétrices de rat RINm5F (2) et les îlots pancréatiques de rat (3). La taille attendue de chaque produit de PCR est indiquée à droite. A et B d’après Weaver et al. (1996), C d’après http://www.t1dbase.org/page/Over-view/display/gene_id/2898, D d’après Inagaki et al. (1995).
50 µm 50 µm 25 µm
GLUK2 ET VIEILLISSEMENT :RÔLE DE L’AUTORÉGULATION DE LA CELLULE α
La sous-unité GluK2 des récepteurs ionotropiques au glutamate, également nommée GluR6, a été montrée comme étant exprimée dans les îlots de Langerhans. En effet, le trans-crit du gène codant pour GluK2 a été détecté dans les îlots pancréatiques de rat (Inagaki et al.
1995). Des études de marquages immunohistochimiques menés sur des îlots de rat ont montré une co-localisation du marquage anti-GluK2 avec le marquage anti-glucagon, mais pas avec les marquages anti-insuline ou anti-somatostatine (Fig 1), révélant une expression protéique de GluK2 dans les cellules α (Weaver et al. 1996).
Il a été montré que le glutamate stimule la sécrétion de glucagon par la cellule α (Bertrand et al. 1993). En effet, le glutamate est co-relargué avec le glucagon par les cellules α et agit comme un signal paracrine via des récepteurs glutamatergiques ionotropiques (iGluR) pour potentialiser la sécrétion de glucagon. L’action instantanée de ce mécanisme sur les cellules α a été bien décrit (Cabrera et al. 2008), mais ses effets à plus long terme sur la fonction des îlots, en particulier sur les cellules β insulinosécrétrices, restent à être caractéri-sés. Cette caractérisation est d’autant plus nécessaire si l’on prend en compte la diminution de la libération d’insuline qui est observée avec l’âge (Iozzo et al. 1999), et qui s’accompagne d’une augmentation de la sécrétion de glucagon (Stumvoll et al. 1998). De plus, il a été mon-tré que la sécrétion d’insuline est d’autant plus diminuée, et la sécrétion de glucagon d’autant plus augmentée, dans les cas de diabètes (Geloneze et al. 2014). En raison de l’augmentation constante de l’espérance de vie et de la prévalence du diabète dans le monde (Wild et al.
2004), les effets de l’âge sur la fonction des îlots, qui jusqu’à présent ont été peu étudiés, constituent une question cruciale.
Étant donné que la cellule α s’autostimule par un mécanisme autocrine impliquant le glutamate, celui-ci pourrait être exacerbé au cours du vieillissement et être responsable de l’augmentation de la sécrétion de glucagon observée chez les individus âgés. De plus, en rai-son des régulations paracrines existant au sein de l’îlot, la cellule α sur-stimulée pourrait alors être responsable, par voie paracrine, de la diminution de la sécrétion d’insuline observée au cours du vieillissement.
L’effet du glutamate par les cellules α implique des iGluR de type AMPA et Kaïnate.
Parmi les iGluR de type Kaïnate, la unité la plus détectée dans les cellules α est la sous-unité GluK2 (Cabrera et al. 2008). Nous avons supposé que chez des animaux génétiquement invalidés pour la sous-unité GluK2 (Mulle et al. 1998), l’autostimulation de la cellule α par le
SECONDE ÉTUDE
glutamate devrait être en partie altérée. Si ce mécanisme s’avère être sur-stimulé au cours du vieillissement comme nous le supposons, les animaux GluK2-/- devraient être en partie proté-gés des effets du vieillissement sur la fonction insulaire.
Nous avons donc entrepris de déterminer quels étaient les effets du vieillissement sur la fonc-tion des îlots chez les souris sauvages et les souris GluK2-/-. Cette seconde étude, dont les ré-sultats préliminaires sont ici présentés, exploite le signal « slow potentials » pour évaluer la sensibilité au glucose des îlots provenant de souris des deux génotypes à deux âges diffé-rents : des jeunes adultes (~10 semaines) et des adultes d’âge moyen (~40 semaines). Ces ex-périences in vitro ont été accompagnées d’expérimentations in vivo afin d’évaluer la réponse au glucose dans un contexte plus physiologique.
Pour la conduite de ce deuxième projet, j’ai soumis une demande de quatrième année de thèse à la FRM qui n’a pas été accordée.
GLUK2 ET VIEILLISSEMENT :RÔLE DE L’AUTORÉGULATION DE LA CELLULE α