L’objectif de ce projet étant de mettre à jour un lien potentiel entre l’architecture hautement organisée du cardiomyocyte et l’efficacité des transferts énergétiques entre les mitochondries et les ATPases impliquées dans les mécanismes régissant la contraction cardiaque, la partie expérimentale de ce travail s’est appuyée sur plusieurs modèles susceptibles de présenter des modifications architecturales importantes. Deux types d’approche ont été privilégiés : l’une consistant à étudier conjointement l’efficacité des transferts énergétiques et la mise en place de l’architecture cellulaire, l’autre s’intéressant aux conséquences de perturbations de cette cytoarchitecture sur le transfert des molécules énergétiques entre les mitochondries et les ATPases.
I. Modèle de mise en place de l’architecture cellulaire
Chez la souris, les quelques semaines suivant la naissance correspondent à une période de transition entre la physiologie fœtale et la physiologie adulte où la cellule cardiaque subit des processus de maturation qui se caractérisent notamment par des évolutions morphologiques et architecturales. La maturation fonctionnelle des micro-domaines énergétiques ainsi que l’évolution de l’architecture cellulaire des cardiomyocytes ont été étudiées chez des souris C57BL6 de différents âges. Les âges ont été rigoureusement sélectionnés de manière à couvrir l’ensemble des phases clés du développement postnatal. Cette étude a ainsi été réalisée chez des souris de 3 jours (phase hyperplasique), 7 jours (phase intermédiaire où hyperplasie et hypertrophie coexistent), 21 jours (période où les derniers évènements mitotiques sont observés), 42 jours (phases purement hypertrophiques) et enfin 63 jours (fin de croissance ou croissance du muscle cardiaque très modérée) (Shafiq et al., 1968 ; Clubb & Bishop, 1984 ; Leu et al., 2001).
II. Modèle de perturbations de l’architecture cellulaire
De nombreux modèles de souris présentant des perturbations importantes de l’architecture cellulaire sont actuellement disponibles ; notamment les souris ayant subi une
invalidation pour un ou plusieurs gènes codant pour des protéines associées au cytosquelette telles que la Muscle Lim Protein (MLP) ou la desmine (Wilding et al., 2006). Pour la réalisation de ce travail, le choix s’est porté sur un modèle de souris ayant un déficit d’expression d’une protéine impliquée dans la dynamique mitochondriale. Cette stratégie repose sur l’hypothèse que la perte ou la diminution d’expression d’une protéine intervenant dans la dynamique mitochondriale devrait avoir des conséquences sur les mitochondries et l’organisation du réseau mitochondrial et à fortiori sur l’architecture globale de la cellule.
Le modèle choisi est le modèle de souris Opa1enu/+ qui porte une mutation conduisant à la diminution d’expression de la protéine OPA1 impliquée dans la fusion de la membrane interne de la mitochondrie. Cette souris, construite par le groupe de Wissinger (Alavi et al., 2007), présente une mutation conduisant au saut d’un exon (exon 10) qui résulte en la production d’un polypeptide ayant un domaine GTPasique incomplet. Cette protéine mutée est inactive et est rapidement dégradée par la voie du protéasome. Le rôle essentiel d’OPA1 dans la physiologie cellulaire n’a pas permis de développer une souris homozygote pour cette mutation puisque ce statut génotypique conduit à une mort in utero seulement huit jours après la fécondation. Ce modèle est donc une souris hétérozygote dont le niveau d’expression d’OPA1 est diminué d’environ 50% lorsqu’il est comparé à celui des souris non mutées provenant du même élevage. Les souris hétérozygotes présentent des atteintes du nerf optique ainsi qu’une dégénérescence progressive des cellules du ganglion rétinien qui sont symptomatiques de l’atrophie optique (ADOA) développée chez l’homme en raison de mutations du gène codant pour la protéine OPA1.
Le phénotype métabolique cardiaque de ce modèle a été caractérisé chez des animaux âgés de cinq mois. Les conséquences de la diminution d’expression de la protéine OPA1 sur la capacité de ces animaux à faire face à un stress ont été étudiées par une exploration de la fonction cardiaque de souris ayant subi la pose d’un clip aortique (stress chronique). Les souris ont ainsi été opérées à l’âge de 4 semaines pour ensuite être euthanasiées 6 semaines plus tard. Pour chacun des types de souris (Opa1+/+ et Opa1+/-), un groupe contrôle, appelé Sham, a été constitué avec des animaux ayant subi l’ensemble de la procédure chirurgicale à l’exception de la pose du clip aortique.
-Matériels et méthodes-
III. Hébergement et sacrifices
Tous les animaux ont été nourris ad libitum et hébergés dans des pièces dans lesquelles l’alternance jour/nuit de 12h/12h et une température constante de 22°C étaient imposées. Le jour du sacrifice, les animaux ont été sortis seulement quelques minutes avant le sacrifice afin d’écourter au maximum la période de stress engendrée par le changement d’environnement. Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pentobarbital (60 mg/kg) et une thoracotomie a été réalisée afin de prélever le cœur. Après un rinçage dans une solution de Krebs sans calcium à 4°C équilibrée avec un gaz composé de 95 % d’O2 et 5 % de CO2, l’organe a subi, en fonction de l’expérimentation postérieure, soit une
canulation de l’aorte permettant une perfusion rétrograde selon la méthode de Langendorff, soit une étape de dissection. Cette dernière a consisté en l’isolement du ventricule gauche dont une partie a été immédiatement plongée dans de l’azote liquide puis conservée à -80°C pour effectuer les analyses biochimiques et moléculaires ultérieures. Le morceau de ventricule restant, pour sa part, a été immédiatement utilisé pour la préparation des fibres ventriculaires nécessaires aux études de la fonction de la mitochondrie in situ. Toutes les procédures d’expérimentation animale ont bien sûr été réalisées dans le respect de la réglementation relative à la protection et à l’utilisation des animaux de laboratoire définie par la directive européenne 86/609/CEE.