Mesure du niveau d’expression génique par RT-PCR quantitative

Le stade de maturation des myofilaments, et plus précisément l’expression génique des isoformes α et β de la chaîne lourde de myosine, a été estimé par la méthode de RT-PCR

-Matériels et méthodes-

quantitative. Cette technique, qui associe une transcription inverse à une réaction de PCR, permet d’amplifier spécifiquement un ADN complémentaire (ADNc) de manière à quantifier le niveau d’expression du gène considéré.

1. Extraction, dosage et qualité des ARN totaux

La mesure du niveau d’expression des gènes des différents modèles animaux a nécessité l’extraction des ARN totaux contenus dans les tissus ventriculaires prélevés lors du sacrifice. Environ 30 mg de tissu ont été homogénéisés dans 1 ml d’une solution de Trizol à 4°C (Gibco BRL, USA) au moyen d’un micro-broyeur Precellys 24 (Bertin, France). Cette solution d’homogénéisation contenant du phénol et de la guanidine isothiocyanate permet une lyse des membranes cellulaires tout en préservant les acides nucléiques intacts. L’homogénat obtenu a été traité avec 200 µl de chloroforme, puis centrifugé à 4°C à 10000G pendant 15 minutes de manière à séparer les ARN, alors contenus dans une phase aqueuse, des protéines présentes dans une phase organique. Après le traitement de la phase aqueuse avec 0,5 ml d’alcool isopropylique durant une nuit à -20°C permettant la précipitation des ARN, une centrifugation à 4°C à 12000G pendant 15 minutes a été effectuée pour obtenir un culot d’ARN. Celui-ci a ensuite été débarrassé de toute trace d’alcool isopropylique par élimination du surnageant et lavage à l’éthanol 75% avant d’être séché et remis en solution dans 20 µl d’eau sans ARNases et ADNases pour être conservé à -80°C.

La concentration d’ARN totaux des solutions obtenues a été déterminée en mesurant l’absorbance de celles-ci à 260 nm, sachant qu’une unité de DO correspond à une concentration en ARN de 40 µg.ml-1. Une mesure additionnelle de l’absorbance de ces solutions à 280 nm a également permis de déterminer la pureté de leur contenu en ARN. Le rapport DO260/DO280 est en effet un bon indicateur de la pureté des échantillons puisque toute

valeur inférieure à 1,5 ou supérieure à 2 indique, respectivement, une contamination par les protéines ou par les acides nucléiques d’origine génomique.

La dernière étape de la préparation a consisté à contrôler la qualité des ARN totaux. Ce contrôle a été réalisé au moyen de cartes microfluidiques analysées par un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) qui examine l’ensemble du contenu des échantillons et calcule un « RNA Integrity Number » (RIN) qui doit être compris entre 7 et 10 pour pouvoir utiliser l’échantillon dans des expériences de RT-PCR quantitative.

2. PCR quantitative : SYBR Green

a. Transcription inverse

La technique de PCR quantitative nécessite une étape préliminaire consistant en une transcription inverse qui conduit à la production d’ADNc à partir des ARN contenus dans les différents échantillons. Cette étape a été réalisée au moyen du kit « SuperScript II Reverse Tanscriptase » (Invitrogen, France) qui utilise une version modifiée de la transcriptase inverse de Moloney Murine Leukemia Virus et des amorces oligonucléotidiques poly-dT complémentaires de la queue poly-A des ARNm. Elle a été effectuée à partir de 5 µg d’ARN mis, pendant 1 heure à 42°C, dans 20 µl d’une solution contenant les différents réactifs du kit dont un inhibiteur d’ARNase.

b. PCR quantitative en temps réel

La technique de PCR quantitative en temps réel consiste à suivre la réplication d’un ADNc ciblé au cours de l’ensemble des cycles d’amplification de la réaction de PCR. Elle s’appuie sur la démarche d’une PCR classique qui consiste en l’alternance des phases de dénaturation de l’ADN double brin (ADNc), d’hybridation des amorces d’oligonucléotides de synthèse (construite pour amplifier les ADNc cibles) et d’élongation. La formation du produit d’intérêt est suivie en temps réel par la présence, dans le milieu réactionnel, d’un intercalant, le SYBR Green, qui émet une fluorescence lorsqu’il est incorporé entre les bases de l’ADN double brin au cours de la phase d’élongation (Figure 32). La mesure de la fluorescence à la fin de chaque cycle est alors utilisée pour quantifier l’ADNc cible dans l’échantillon et par conséquent déterminer le niveau d’expression du gène dans le modèle considéré.

Le succès d’une quantification d’ADNc par la méthode de PCR quantitative réside essentiellement dans la construction d’amorces spécifiques de la séquence à amplifier. Les amorces utilisées au cours de cette étude ont été désignées au moyen du logiciel Primer 3 et leur spécificité a été vérifiée par le logiciel BLAST. Les amorces « sens » et « anti-sens » ont été choisies dans deux exons différents de manière à détecter une contamination par l’ADN génomique.

Les réactions de PCR ont été effectuées dans des capillaires de verre dans un milieu réactionnel d’un volume total de 15 µl composé de 12,5 ng d’ADNc, 0,5 µM de chacune des amorces, 3 µM de MgCl2, et 1,5 µl de MasterMix (Roche) contenant des dNTP (nucléotides),

-Matériels et méthodes-

Figure 32 : Détection des produits de PCR par la méthode du SYBR green.

Le SYBR green est ajouté dans le milieu réactionnel et s’intercale dans l’ADN double brin produit lors de la phase d’élongation de la réaction de PCR. Le SYBR green intercalé émet alors une fluorescence qui peut être mesurée.

le SYBR Green et la Taq-polymérase. Les capillaires ont alors été déposés dans un thermocycleur LightCycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) pour être soumis à un nombre de cycles « dénaturation-hybridation-élongation » variant de 30 à 40 selon les gènes étudiés. A la fin du protocole d’amplification, la courbe de fusion du produit formé a été réalisée de manière à vérifier la spécificité de la réaction de PCR.

c. Analyse des résultats

La quantification du niveau d’expression des différents gènes a été réalisée à partir du calcul du « threshold cycle » (Ct ou cycle-seuil) qui correspond au nombre de cycles nécessaire à la détection de la fluorescence du SYBR Green. Le Ct étant inversement proportionnel au logarithme de la concentration d’ADNc contenue dans les échantillons, la concentration d’ARNm a été déterminée à partir d’une courbe linéaire standard déterminée avec une gamme de dilution (5 dilutions d’un échantillon donné pour chacun des gènes). Dans le but de s’affranchir des différences d’efficacité de la reverse transcriptase et des erreurs de manipulation entre les différents échantillons ; ces valeurs ont été normalisées à l’expression de gènes de référence (TBP et GAPDH) pour lesquelles les conditions expérimentales n’ont pas d’effet sur l’expression.

VI. Etude du profil métabolique

Le métabolisme énergétique d’un organe comme le cœur est, de manière générale, une composante difficile à appréhender. De manière à disposer d’un maximum d’éléments pour éclaircir le champ d’investigation et faciliter la compréhension de l’ensemble des données obtenues durant les différentes études, une caractérisation de nombreux paramètres concernant le profil métabolique des modèles a été réalisée. Cette partie du travail a ainsi pu recourir à des techniques de dosage d’enzymes comme la CK (impliquée dans les transferts énergétiques) ou la LDH (affichant l’orientation plus ou moins glycolytique du métabolisme de l’organe) ou encore des techniques mesurant le niveau d’expression génique des nombreux gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire.

-Matériels et méthodes-