Mesure d’activité enzymatique

La fonction des mitochondries a également été approchée par la mesure de l’activité d’enzymes mitochondriales. Au cours de ce travail, trois enzymes ont été étudiées : le complexe I, le complexe IV et la citrate synthase (CS).

1. Extraction et dosage des protéines.

La mesure d’activité enzymatique a nécessité l’extraction des protéines contenues dans les tissus ventriculaires prélevés lors du sacrifice des animaux. Environ 30 mg de tissu pour 1 ml de tampon d’homogénéisation à 4°C (en mM : HEPES 5, EGTA 1, DTT 1, TritonX100 0,1% ; pH = 8,7) ont donc été homogénéisés au moyen d’un micro-broyeur Precellys 24 (Bertin, France).

La concentration protéique des solutions obtenues après l’étape de broyage a ensuite été mesurée par une méthode de colorimétrie utilisant la réduction, en milieu alcalin à 60°C, de l’ion Cu2+en ion Cu+ par les protéines, suivie de la formation d’un complexe avec l’acide bicinchoninique (BCA-Cu) présentant une absorbance à 560 nm.

Protéine + Cu2+ → Protéine-Cu + Cu+

Cette mesure d’absorbance a également été faite sur une gamme connue de concentrations de BSA ayant subi les mêmes réactions colorimétriques, permettant ainsi la quantification précise de la concentration de protéines des différents échantillons.

2. Dosages enzymatiques

a. Le complexe I

Le complexe I de la chaîne respiratoire est responsable de l’oxydation du NADH en NAD+. Par conséquent, son activité a été dosée en suivant, pendant 3 minutes, la disparation du NADH dont l’absorbance à 340 nm en fait un parfait rapporteur des processus réactionnels. L’accepteur d’électrons naturel du complexe I, l’ubiquinone aussi appelée Coenzyme Q10, a été remplacé par la décylubiquinone (ou le décyl-Coenzyme Q10) qui est

beaucoup plus hydrophile et facilite ainsi le dosage qui a été réalisé en milieu aqueux dans un tampon phosphate 50 mM à 30°C contenant 3,75mg/ml de BSA, 100 µM de NADH et 100 µM de décylubiquinone (pH 7,5).

NADH,H+ + Décyl-CoQ → NAD+ + Décyl-CoQH2

Etant donné que les extraits protéiques contiennent l’ensemble des protéines exprimées par le tissu, l’oxydation du NADH n’est pas exclusivement réalisée par le complexe I dans ces conditions expérimentales. Il existe en effet d’autres protéines, et notamment le cytochrome b5 oxydoréductase, capable d’oxyder le NADH. C’est pourquoi une

mesure de la consommation du NADH en présence de roténone (un inhibiteur spécifique du complexe I) a été réalisée en parallèle. L’activité du complexe I a ainsi pu être calculée puisqu’elle représente la partie sensible à la roténone de l’activité NADH oxydase totale.

b. Le complexe IV

Le complexe IV, ou cytochrome-c oxydase (COX), est responsable de l’oxydation du cytochrome-c préalablement réduit par le complexe III (cytochrome-c réductase). Son activité est dosée dans un tampon phosphate 50 mM (pH 7,4) contenant 50 µM de cytochrome-c réduit à 90% (par ajout de dithionite de sodium) à 30°C.

-Matériels et méthodes-

Le cytochrome-c n’ayant pas le même spectre d’absorption à l’état réduit et l’état oxydé, la disparition de la forme réduite, révélatrice de l’activité de la COX, est suivie pendant 3 minutes à 550 nm.

c. La citrate synthase

La CS est une enzyme impliquée dans le cycle de Krebs qui est traditionnellement utilisée pour estimer la masse mitochondriale car son activité est révélatrice de la quantité de mitochondries fonctionnelles dans le tissu. Elle catalyse la réaction de condensation de l’acetyl-CoA, obtenu à partir des réactions cataboliques des sucres et des acides gras, et de l’oxaloacétate pour former l’acide citrique (ou citrate).

Acétyl-CoA + Oxaloacétate + H2O ↔ Citrate + CoASH

De la même manière que pour la mesure de l’activité des complexes, le dosage a été réalisé au moyen de méthodes spectrophotométriques. La réaction précédemment décrite ne permet cependant pas de mesurer directement la disparition ou l’apparition d’un des composants engagés dans la réaction. C’est pourquoi du DNTB (5,5’-dittiobis-(2- Nitrobenzenoic acid) a été ajouté dans le milieu réactionnel. L’interaction de ce composé avec le CoaSH formé par la réaction régie par CS conduit à la formation de l’ion mercaptique (C6O4S2-) qui présente un spectre d’absorption à une longueur d’onde de 412 nm.

CoASH + DNTB → CoAS + H+ + C6O4S2-

Le dosage de l’activité de la CS a ainsi été effectué en suivant l’apparition de l’ion mercaptique dans le milieu réactionnel pendant 3 minutes à 30°C.

d. Analyse des données de spectrophotométrie

La méthode de quantification par spectrophotométrie se base sur la loi de Beer Lambert selon laquelle l’absorbance d’une solution, à une longueur d’onde donnée, est proportionnelle à la concentration des substances en solution capables d’absorber les rayons lumineux à cette longueur d’onde. L’évolution de la Densité Optique (DO) de chacun des échantillons au cours d’un protocole donné est donc proportionnellement liée à l’apparition ou

la disparation de la molécule absorbante. Ceci permet ainsi le calcul de l’activité de l’enzyme (AE) considérée avec la formule suivante : AE = ((DOfinale - DOinitiale).F)/(ε.L.Δt) où F

correspond au facteur de dilution de l’échantillon, ε à l’absorptivité molaire de la molécule absorbante (L.mol-1.cm-1)(εNADH = 6220 ; εCyt-c réduit = 18500 ; ε C6O4S2- = 13600), L à la

longueur de la cuve (1 cm) et Δt au temps de mesure. Cette activité a enfin été rapportée à la concentration protéique des échantillons de manière à être exprimée en µM.min-1 par gramme de protéines.

IV. Etude des transferts énergétiques

Le but du projet étant de corréler l’organisation architecturale et l’efficacité des transferts énergétiques, des techniques permettant de mesurer la capacité des différents acteurs à approvisionner les ATPases en énergie ont été utilisées. Ces mesures ont été réalisées à partir de fibres perméabilisées à la saponine qui ont été montées sur un dispositif capable de mesurer la tension développée par celles-ci (Figure 31). Il est à noter que les fibres perméabilisées ont été préparées, selon la méthode décrite précédemment, dans une solution relaxante contenant (en mM) : EGTA (10), BES (60), Mg2+ libre (1), taurine (20), acide glutamique (10), acide malique (4), K2HPO4 (3), dithiothréitol (0,5), MgATP (3,16),

phosphocreatine (12) ainsi que du potassium-methasulfonate permettant d’ajuster la force ionique à 160 mmol.L-1 et 6% de dextran assurant le maintien du volume cellulaire. Deux protocoles différents ont été élaborés afin d’estimer l’efficacité des transferts d’énergie au niveau de SERCA et de l’ATPase de la myosine.