5. Analyses NanoSIMS des UCAMMs
5.5. Mesures des rapports D/H en ions polyatomiques
O método escolhido para a extração de ADN das amostras de sangue total post mortem demonstrou ser satisfatório, tendo sido possível obter concentrações aceitáveis na generalidade das amostras. No entanto, algumas sequências apresentaram ruído que, por comparação com as amostras de referência utilizadas no ensaio de exatidão e de limite de detecção, devem-se à qualidade de ADN utilizado (Stephen, Lin, & Lai, 2015). Por essa razão, a extração poderá ser otimizada utilizando outras metodologias com melhor recuperação e qualidade de resultados.
A sequenciação do fragmento 3, que permite a identificação do alelo CYP2D6*3, deverá ser otimizada através da seleção de novos primers, em particular o anti-sense (R3), de forma a permitir a amplificação de um fragmento específico e seletivo, com um número razoável de pb, que permita obter 2 sequências (sense e anti-sense) de todo o fragmento e em que a variante alvo (2549A>G) fique centrada, para facilitar a sua identificação. O alelo CYP2D6*5, ou seja a deleção do gene inteiro, é um alelo nulo com uma frequência significativa (2,7%) mas apenas os indivíduos homozigóticos para este alelo têm alterações metabólicas. No entanto, seria importante o desenvolvimento e validação de uma metodologia para a detecção da variação do número de cópias (Bodin, Beaune, & Loriot, 2005). Tal permitiria também a identificação dos metabolizadores ultra-rápidos que são um genótipo particularmente sensível, no caso da administração de substâncias que necessitam da bioativação, como o tramadol e a codeína, podendo estar na origem de intoxicações (Madadi et al., 2008; Orliaguet et al., 2015; Sallee et al., 2000).
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A evolução rápida das técnicas de biologia molecular como a sequenciação de nova geração (NGS) (Rehm et al., 2013) que permitirá a sequenciação integral do gene CYP2D6 e se necessário dos seus pseudogenes, associada a metodologias que identifiquem CNV de forma mais fácil como real-time PCR (Bodin et al., 2005; Book et al., 2013; Schaeffeler, Schwab, Eichelbaum, & Zanger, 2003), permitirá a genotipagem completa com a identificação de outras variantes, a seleção de melhores biomarcadores e estabelecer correlações melhores com os fenótipos observados. No entanto, as características complexas associadas aos polimorfismos do gene CYP2D6, nomeadamente a sua semelhança com os pseudogenes e a existência de hibridação, constitui um grande desafio quer para os especialistas em análise genética quer para o desenvolvimento e utilização de ferramentas informáticas adequadas (Gaedigk, 2013). Na análise toxicológica, a utilização de uma metodologia mais sensível, que permita a identificação e quantificação dos metabolitos e a distinção enanteomérica, por LC/MS, poderá contribuir para aumentar a correlação com os genótipos A metodologia de sequenciação pode ser complementada quando se considere necessário com novos fragmentos para identificar outros polimorfismos. Poderá também ser aplicada a casos positivos para outras substâncias que metabolizem pela mesma via (CYP2D6), tais como antidepressivos (amitriptilina e nortriptilina (Hicks et al., 2013; Koski et al., 2006), citalopram (Holmgren et al., 2004), fluoxetina (Z. Wang et al., 2014)), antipsicóticos (haloperidol (Brockmöller et al., 2002)) ou outros analgésicos opióides (codeína (Madadi et al., 2008; Yee, Atayee, Best, & Ma, 2014), metadona (Fonseca et al., 2011; Shiran et al., 2009)).
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8 Conclusões
As metodologias desenvolvidas e validadas para a identificação das variantes nulas mais prevalentes do gene CYP2D6 e para a quantificação de tramadol e metabolitos em amostras de sangue post mortem demonstraram ser sensíveis, seletivas, específicas, exatas, precisas e robustas, sendo adequadas à rotina pericial e à análise de amostras forenses até 3 anos após a colheita.
As 100 amostras de sangue post mortem, selecionadas da casuística do SQTF entre 2012 e 2015 e positivas para tramadol, foram analisadas pelas metodologias desenvolvidas. Foi possível a análise toxicológica de todas as amostras selecionadas e a genotipagem de 97. Os resultados obtidos pelas duas metodologias foram comparados e verificou-se a existência de uma relação entre a razão de concentrações dos metabolitos do tramadol (NDT/ODT) e os diferentes genótipos, em particular para o perfil metabólico dos metabolizadores lentos que é estatisticamente diferente dos metabolizadores extensivos/normais e intermédios. Este parâmetro pode ser uma alternativa para a avaliação das características metabólicas especialmente em casos
post mortem.
A análise dos resultados destas metodologias e o cruzamento com informação toxicológica adicional permitiu ainda concluir que a triagem e identificação de substâncias responsáveis pela inibição enzimática da CYP2D6 que estejam presentes nas amostras com tramadol é fundamental para a interpretação das concentrações obtidas.
A utilização da farmacogenética post mortem só é possível se, tendo sempre em conta os fatores externos e circunstanciais, houver uma correta articulação dos conhecimentos da patologia, da toxicologia e da genética forenses.
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