Figure 45 : Mesure du taux d’expression protéique par Western-blot.
Cette technique repose sur 6 étapes principales, 1) préparation des échantillons, 2) séparation des protéines sur gel, 3) transfert des protéines migrées sur une membrane, 4) saturation de la membrane, 5) immuno-révélation des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques et pour finir 6) analyse par chimioluminescence. (Source : Molecular station)
‐Matériels & Méthodes‐IV‐ Les échantillons analysés du gastrocnémien superficiel ont été le plus souvent préparés en tampon d’homogénéisation avec du DTT, selon le protocole indiqué en (IV.1.2), puis dosés par la technique BCA. Avec ce mode d’extraction, l’inconvénient est que les protéines ne sont pas extraites dans un tampon contenant des anti- phosphatases et anti-protéases pour inhiber ces enzymes susceptibles d’agir sur les protéines d’intérêt. L’absence d’inhibiteurs empêche toute éventuelle révélation- quantification fiable du taux de phosphorylation de ces protéines.
2.1.b-Dénaturation des protéines
Pour séparer les protéines uniquement selon leur masse lors de la migration, il est nécessaire de les dénaturer (seules les liaisons secondaires sont désorganisées) (Figure 45.1). Une quantité identique et adaptée de protéines totales (50µg dans 12µl) est mise en contact avec 12µl de tampon de charge 2X (mélange de bleu / SDS / glycérol / DTT). Le SDS est un détergent anionique lipophile qui supprime les liaisons non-covalentes de la protéine, et confère à la protéine une charge globale négative proportionnelle à sa masse, ce qui facilite sa solubilisation. La chaîne polypeptidique est partiellement dépliée par l’action complémentaire du DTT qui réduit aussi les ponts disulfures. Le glycérol facilite le dépôt des échantillons au fond des puits du gel en augmentant la densité de l'échantillon par rapport au tampon. Les protéines sont ensuite totalement dénaturées par une brève dénaturation thermique (5min à 95°C).
Afin de suivre en temps réel la migration, un marqueur de poids moléculaire (Euromedex) est ajouté également dans un des puits de dépôt.
2.2-Migration des protéines par électrophorèse sur gel SDS-PAGE
En condition SDS-PAGE, les protéines de l'échantillon sont chargées négativement par la présence de SDS, donc leur migration, au travers d'un gel de polyacrylamide sous l'influence d'un champ électrique, va se faire uniquement en fonction de leur poids moléculaire dans une dimension (Figure 45.2).
La migration s’effectue au travers de deux gels de polyacrylamide successifs avec un pourcentage croissant (composition indiquée ci-dessous). Le gel supérieur contenant les puits de dépôt a pour rôle de concentrer les protéines à l’interface entre les deux gels, tandis que le gel inférieur a pour rôle de séparer les protéines en
fonction de leur poids moléculaire. La concentration en polyacrylamide du gel de séparation est fonction du poids de la protéine d’intérêt (6-12%), plus la concentration est élevée, plus les petites protéines sont séparées finement. La migration au travers des gels s’effectue pendant 2h à 150V, en présence de tampon de migration permettant la conduction du courant et de limiter l’échauffement du dispositif.
Composition des gels en %: gel supérieur 5% (Acrylamide 5 ; SDS, AP et TEMED 0,1 ; Tris 125mM ; pH6.8), gel inférieur 8% (Acrylamide 8 ; SDS et AP 0,1 ; TEMED 0,06 ; Tris 380mM ; pH8.8) et du tampon de migration en g/L (Tris 15 ; SDS 5 ; glycine 72).
2.3-Electro-transfert des protéines sur membrane
Afin de rendre les protéines accessibles au protocole de détection, elles sont transférées depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose (Hybond-P). La fixation des protéines à la membrane se fait par des interactions hydrophobes et ioniques. Après l’électrophorèse, à l’aide d’un système (BioRad) composé de papiers whatman
et d’éponges, le gel (borne-) est placé face-à-face avec la membrane activée par du
méthanol (borne+), et un courant électrique est appliqué de part et d’autre à travers
des électrodes. Les protéines chargées négativement migrent alors depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel (Figure 45.3). Le transfert des protéines vers la membrane s’effectue pendant 1h30 à 150V à 4°C dans du tampon de transfert (en mM : Glycine 40 ; Tris 25 ; méthanol 20%).
2.4-Immunodétection des protéines d’intérêt 2.4.a-Saturation de la membrane
La membrane ayant été choisie pour ses propriétés de liaisons non- spécifiques pour fixer les protéines d’intérêt, il est donc nécessaire de minimiser les interactions pouvant se former entre la membrane et les anticorps déposés. La
‐Matériels & Méthodes‐IV‐ Après le transfert, la membrane est brièvement rincée (5min) dans une solution
PBST (en mM : NaCl 140 ; PO4HNa2 (2H2O) 9 ; PO4H2Na 1 ; Tween 0,1%), puis
saturée pendant 1h à 4°C avec 5% de lait en poudre sans AG.
2.4.b-Anticorps primaire
Après le blocage, la membrane est rincée du lait excédentaire par un lavage de 10min avec PBST sous agitation. La membrane est ensuite incubée sur la nuit à 4°C, sous agitation modérée, avec une solution d’Ac-I (0,5-5µg/ml) diluée en BSA 5% - PBST. L’Ac-I utilisé est dirigé spécifiquement contre un épitope de la forme dénaturée de la protéine d’intérêt (Figure 45.5).
2.4.c-Anticorps secondaire
Après 3 rinçages successifs au PBST (10min), afin d'enlever les Ac-I non liés, la membrane est incubée à un Ac-II dilué en lait 5% - PBST, pendant 1h à température ambiante, sous agitation modérée.
Il s’agit d’une étape de révélation et d’amplification du signal. Car cet Ac-II est dirigé contre une portion espèce-spécifique de l’Ac-I, et il est couplé à une enzyme HRP (Horseradish peroxidase), ce qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane. De plus, plusieurs Ac-II peuvent se lier au même Ac-I, ce qui provoque l’amélioration de la puissance du signal localisé.
2.4.d-Révélation par chimioluminescence
La révélation s’effectue par chimioluminescence avec le kit HRP (Immobilion
Western ; Milipore). Cette méthode de détection est la plus sensible pour l'analyse
des WBs. Elle consiste à mettre en contact la peroxydase de l’Ac-II avec le substrat du kit ECL. Lorsque le substrat est oxydé par l’enzyme, cela produit une luminescence proportionnelle à la concentration en protéine. La lumière émise par la réaction est ensuite enregistrée numériquement à l’aide d’une caméra CCD (Figure
45.6).
Après 3 rinçages successifs au PBST (10min), afin d'enlever les Ac-II non liés, la membrane est incubée 5min avec le substrat ECL, avant d’être lue à l’aide du système Chemidoc XRS (Bio-Rad).
2.5-Analyse des acquisitions
L’identification de la bande correspondante à notre protéine d’intérêt est réalisée en comparant la taille approximative des bandes marquées à celles du marqueur de poids moléculaire. Puis, la quantification du signal est effectuée par densitométrie à l’aide du logiciel Quantity one (BioRad). Le taux relatif de marquage de la protéine est alors exprimé en densité optique.
Afin de corriger un transfert incomplet ou les éventuelles erreurs expérimentales, le taux de la protéine-cible est normalisé à une protéine de charge (CS) servant de contrôle interne.