Pour caractériser la fonction mitochondriale du ventricule gauche, l’activité totale des enzymes de la citrate synthase (CS), les cytochromes c oxydase I et IV ont été mesurées. L’étude du profil métabolique des muscles squelettiques (gastrocnémien superficiel, plantaire et soléaire) après un entraînement a été estimée par la mesure de l’activité d’enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique : la CS, la Cox IV, la créatine kinase (CK), la lactate déshydrogénase (LDH), l’adénylate kinase (AK), la hydroxyacylCoA dehydrogenase (HADHA). Tous ces dosages ont été effectués par spectrophotométrie à des longueurs d’onde spécifiques à chaque réactif. En outre, les différentes isoformes de l’enzyme CK (mi- CK, MM-CK, MB-CK, BB-CK) ont été séparées par électrophorèse sur gel d’agarose.
1.1-Extraction des enzymes
Les différents tissus congelés ont été découpés et pesés (10-15mg), avant d’être homogénéisés à l’aide d’un micro-broyeur Precellys 24 (Bertin, France) dans 200µl de tampon d’homogénéisation à 4°C (mM : HEPES 5, EGTA 1 et DTT 1, Triton X100 0,1% ; à pH 8,7). Cette étape rapide permet l’extraction complète de toutes les enzymes, tout en minimisant la possible intervention de protéases. Les extraits protéiques ainsi obtenus sont ensuite aliquotés et congelés, avant d’être dosés par la méthode BCA (acide bicinchoninique ; voir ci-après).
1.2-Extraction et dosages des protéines
La méthode BCA a été mise au point par Paul Smith en 1985, et est un dérivé de la méthode au Biuret (GORNALL et al., 1949). Il s’agit d’un dosage colorimétrique
des protéines, basé sur l'acide bicinchonique. En milieu alcalin, les ions cuivre Cu2+
se complexent aux liaisons peptidiques des protéines et sont alors réduits en ions
cuivreux Cu+. Le BCA est un réactif colorigène hautement spécifique pour le Cu+, qui
forme un complexe pourpre ayant une absorption optique maximale à 562nm. L'absorbance est proportionnelle à la concentration de protéines (utilisable dans une gamme de 0.5µg/ml-2mg/ml). Cette méthode a l’avantage d’être sensible et rapide et de résister aux détergents comme le Triton ou le SDS. La concentration protéique de chaque extrait dilué dans l’eau est déterminée grâce à une gamme étalon de BSA (Bovin serum albumin), avec 7 concentrations dosées en parallèle (0 µg/ml-1mg/ml). Dans une plaque de 96 puits à fond plat, les dosages ont été effectués en double, voir quadruple, avec un volume de 20µl/puits, combinés à 200µl/puits d’un mélange de BCA et de sulfate de cuivre 4%. L’ensemble est incubé 15min à 60°C pour accélérer la réaction, puis lu à l’aide d’un lecteur de plaque TECAN à 562nm.
1.3-Dosage enzymatique des activités totales
Le dosage des activités enzymatiques s’est fait en évaluant les propriétés cinétiques des enzymes, qui sont proportionnelles à leur concentration.
1.3.a-Activité totale de la citrate synthase (CS)
La CS est une enzyme du cycle de Krebs utilisée comme marqueur de l’activité et de la masse mitochondriale. En effet, son activité est corrélée à la quantité de mitochondries contenues dans le tissu analysé. Elle catalyse la formation de citrate à partir d’oxaloacétate et de l’acétyl-CoA issu du catabolisme glucidique et lipidique.
Acétyl-CoA + Oxaloacétate + H2O
↔
Citrate + CoA-SH‐Matériels & Méthodes‐IV‐ ajouté au milieu réactionnel. Ce composé interagit avec le CoASH libéré, et produit des ions mercaptiques possédant une absorption spécifique à 412nm.
CoASH + DNTB → CoAS + H+ +C6O4S2-
L’activité de la CS est donc dosée en suivant l’augmentation de l’absorbance due à la production d’ions mercaptiques dans le milieu réactionnel (mM : Tris 100 ; DNTB 0,1 ; Acétyl-CoA 0,3 ; OAA 0,5 ; pH 8,0) pendant 3min à 30°C à 412nm.
1.3.b-Activité totale de la COX
La COX, complexe IV de la chaîne respiratoire, se trouve dans la membrane interne des mitochondries. Elle intervient dans le processus de phosphorylation oxydative de l’ATP. Elle est responsable de l’oxydation du cytochrome-c préalablement réduit par le complexe III (cytochrome-c réductase).
Cytochrome c réduit +O2 → Cytochrome c oxydé + H2O
Le cytochrome c réduit et le cytochrome c oxydé n’ayant pas le même spectre d’absorption, il est donc possible de les suivre séparément. L’activité de la COX est dosée en suivant spécifiquement la disparition de l’absorbance du cytochrome c réduit, à partir de cytochrome c réduit à 90% (50µM par ajout de dithionite de sodium) dans un tampon phosphate (50mM ; pH 7,4) pendant 3min à 30°C à 550nm.
1.3.c-Activité totale de la CK et de l’AK
Comme nous l’avons présenté auparavant, la CK catalyse le transfert d’énergie à partir de PCr.
PCr +ADP + H+
↔
Cr + ATPComme pour la CS, aucun des produits participant à la réaction ne sont directement mesurables par spectrophotométrie. Il est donc nécessaire d’effectuer un couplage enzymatique de l’un des éléments réactionnels, pour obtenir un produit ayant une propriété spectrale spécifique. L’ATP formé par la réaction est utilisé comme substrat dans les réactions de couplages suivantes :
ATP + Glucose
↔
Glucose-6-Phosphate (G6P) +ADP catalysée par l’HK ADP + NADP+↔
Gluconate-6-Phosphate +NADPH,H+ catalysée par la G6PDH (Nomenclature : HK : Hexokinase ; G6PDH : Glucose-6-phosphate déshydrogénase)Le NADPH,H+ produit possède une absorbance spécifique à 340nm. Toutefois, l’AK présente aussi dans les tissus utilise pareillement l’ADP pour former l’ATP.
2 ADP
↔
AMP +ATP catalysée par l’AKIl est donc indispensable de mesurer en premier l’activité de l’AK seule, afin d’éliminer son interférence dans la mesure de l’activité de la CK. L’activité de l’AK est dosée en suivant l’apparition de l’absorbance du NADP réduit dans le tampon réactionnel (mM : HEPES 20 ; Mg-acétate 5 ; DTT 0,5 ; glucose 20 ; ADP 1,2 ;
NADP+ 0,6 ; pH 7,4 ; HK 5U/ml ; G PDH 3,7 U/ml) pendant 3min à 30°C à 340nm.
Puis l’activité de la AK + CK est ensuite mesurée par ajout de 10mM de PCr. L’activité de la CK seule est quantifiée par soustraction de l’activité totale AK +CK à celle de l’AK seule.
1.3.d-Activité totale de la LDH
Comme indiqué précédemment, la LDH intervient dans la catalyse de transformation du pyruvate en lactate.
Pyruvate + NADH,H+
↔
Lactate +NAD+Or, le NADH,H+ absorbe spécifiquement à la longueur d’onde de 340nm.
L’activité de la LDH est donc dosée en suivant spécifiquement la disparition de
l’absorbance du NADH,H+ réduit dans un tampon réactionnel (mM : K2HPO4 34,1 ;
KH2PO4 7,35 ; Na pyruvate 0,63 ; NADHNa2 12,4 ; NAHCO3 0,12 ; pH 7,4) pendant
3min à 30°C à 340nm.
1.3.e-Activité totale de la HADHA
La HADHA est une enzyme du cycle de β-oxydation avec une affinité spécifique pour les substrats à longue chaîne, elle est utilisée comme marqueur de l’activité de la voie d’utilisation des AG. Elle se situe dans la membrane interne des mitochondries, et catalyse l'hydratation de l'énoyl-CoA et aussi la déshydrogénation du 3-hydroxyacyl-CoA.
AcétoacétylCoa + NADH,H+
↔
Hydroxy-butyryl-CoA + NAD+‐Matériels & Méthodes‐IV‐ dans un tampon réactionnel (mM : Na2H2P2O7 100 ; EDTA 1 ; NADH 0,15 ; AcétoacétylCoA 0,05 ; pH 7,3) pendant 3min à 30°C à 340nm.
1.3.f-Analyse des données spectrophotométriques
La technique de dosage par spectrophotométrie repose sur la loi de Beer- Lambert (DO = ε x l x C°). Cette relation empirique relie l'absorption de la lumière aux propriétés des milieux qu'elle traverse, en établissant une proportionnalité entre la concentration d'une substance en solution homogène, l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution. L’évolution de la densité optique (DO) au cours du temps est donc proportionnellement liée à l’apparition ou la disparition de l’absorbance de la molécule étudiée.
D’où le calcul de l’activité enzymatique (AE ; en UI (µmole.min-1)), avec la
formule suivante : AE = ((DOfinale – DOinitiale) x Fd) / (ε x l x Δt) où Fd : facteur de
dilution de l’échantillon, ε :le coefficient d’extinction molaire de la molécule suivie
(L.mol-1.cm-1 ; εNADH = 6.220 ; ε Cyt-c réduit = 18.500 ; ε C6O4S2-= 13.600), l : la
longueur de la cuve (1cm) et Δt : le temps de mesure (3min).
L’activité enzymatique de chaque enzyme est normalisée en étant ramenée à la concentration protéique des échantillons mesurés (UI/g prot).
1.4-Quantification des isoformes de la CK
Le principe de la mesure de l’activité des isoformes de la CK est le même que pour déterminer l’activité totale des enzymes après séparation sur gel d’agarose. Pour éviter la saturation du signal MM-CK due à sa forte majorité, deux dilutions de chaque échantillon sont effectuées.
1.4.a-Migration et révélation des gels
Les isoformes ayant des tailles diverses, elles sont facilement identifiables de par leur migration à des positions différentes et spécifiques. L’activité des différentes isoenzymes est déterminée après séparation par migration sur gel d’agarose 1% à 250V pendant 1h30. Les gels sont ensuite incubés dans une solution de coloration (mM : MES 22 ;Mg-acétate 50 ; Glucose 70 ; N-acetylcysteine 120 ; ADP 9 ; PCr
6UI/ml) à l’obscurité pendant 50min. La fluorescence émise par le NADPH,H+ est visible dans les UV.
1.4.b-Quantification des gels
Chacune des bandes obtenues après le couplage enzymatique correspond à une isoenzyme, et émet un signal dont l’intensité est directement proportionnelle à l’activité de l’isoenzyme. Pour traiter les informations quantitativement, les gels sont scannés à l’aide du système Chemidoc XRS (Bio-Rad) et l’intensité relevée pour chaque bande est calculée à l’aide du logiciel Quantity One. Puis, l’activité des isoenzymes est déterminée à l’aide de la proportion qu’elle représente dans l’extrait, en pourcentage de l’activité totale mesurée pour la CK.