Matériel et méthodes .1 Echantillonnage

I.2.1 Introduction

Suite au développement de la méthode de digestion des tissus des produits de la pêche au KOH 10% (Section I.1), des difficultés ont été rencontrées pour la digestion des tractus gastro-intestinaux (TGI) d’une espèce de poisson : le merlan (Merlangius merlangus). Cette espèce faisant partie intégrante de l’échantillonnage des produits de la pêche réalisé pour évaluer la contamination aux MP de ces produits (Chapitre 3), il a été nécessaire de résoudre le problème de digestion des TGI. L’objectif des manipulations était d’améliorer la digestion des TGI des merlans de l’échantillonnage en (i) modifiant les paramètres de digestion (temps d’incubation, ratio de KOH/g de chair, vitesse d’agitation, concentration KOH), en (ii) modifiant la porosité des filtres utilisés ou en (iii) appliquant un prétraitement.

I.2.2 Matériel et méthodes I.2.2.1 Echantillonnage

Les merlans ont été achetés localement chez les pêcheurs ou dans un supermarché. La masse de chaque TGI a été pesé (Sartorius CP3202S, Dourdan, France) permettant de les classer en trois catégories distinctes en fonction de leurs masses : <10 g, [10 – 20 g] et >20 g. I.2.2.2 Paramètres de digestions initiaux

La digestion des TGI a été réalisée en utilisant un ratio initial de 7,5 mL de KOH/g de chair (KOH 10% (p/p) - ChimiePlus, Saint Paul de Varax, France) avec une agitation de 300 rpm (tour par minute) (2mag MIXDrive 6 HT, Munich, Allemagne) pendant 24h dans un incubateur (Binder BD 240, Tuttlingen, Allemagne) réglé à 60 ± 1°C. La filtration a été réalisée avec des filtres en fibre de verre GF/A de porosité 1,6 µm (Whatman, Velizy-Villacoublay, France) à l’aide d’un système à vide Büchner. Pour toutes les approches, la filtration est rélaisée de la manière décrite ci-dessus et seul les autres paramètres peuvent être modifiés.

I.2.2.3 Modifications des paramètres de digestion

I.2.2.3.1 Approche 1 : Modification de la vitesse d’agitation, du ratio et du temps d’incubation

Une première approche a consisté à modifier les paramètres suivants : vitesse d’agitation, temps d’incubation et ratio de KOH/g de chair. Cette approche résulte en un total

de 9 expériences (Figure 16). Pour chaque expérience, 3 TGI de merlan des classes [10 – 20 g] ou > 20 g ont été utilisés.

Figure 16 : Représentation des paramètres étudiés dans le plan d'expérience visant à évaluer les paramètres optimaux pour la digestion des tubes digestifs de poisson.

Pour chaque expérience, l’efficacité de digestion (%De) a été calculée selon la formule suivante où DWfad correspond à la masse du filtre après filtration, DWf correspond à la masse du filtre avant filtration et Tw correspond à la masse du TGI de l’individu.

%𝐷𝑒 = 100 − (^{𝐷𝑊𝑓𝑎𝑑− 𝐷𝑊𝑓}

𝑇_𝑤 ^{× 100)}

Si la filtration n’est pas réalisée entièrement, un %De de zéro est alors appliqué. Les filtres ont été pesés sur une balance de précision 0,01 g (Sartorius CP3202S, Dourdan, France). De plus pour chaque expérience, le %De moyen est calculé.

I.2.2.3.2 Approche 2 : Application d’un prétraitement

Afin d’améliorer la digestion des TGI de merlans, des prétraitements ont été appliqués. Ces prétraitements incluaient la cuisson de l’échantillon à 150°C pendant 24h ou à 60°C pendant 72h (Firlabo, Emerainville, France), la lyophilisation de l’échantillon pendant 24h (CHRIST Alpha 2-4 LD, Osterode am Harz, Allemagne) et l’ajout de Tween 80 ® (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) à 0,005% (essai 1 à 4 – Tableau 7). Dans les cas de la cuisson à 60°C, la lyophilisation et de l’ajout de Tween, une décantation avant la filtration a été réalisée avec du Tungstate de sodium à 70% (p/p) (NaW – Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) en utilisant deux volumes de NaW pour un volume de KOH 10%. De plus, dans le cas de l’autolyse des TGI, un volume fixe de 500 mL pour trois TGI de la classe > 20

Ratio Chair/KOH

g a été utilisé menant à un ratio inférieur à 16 mL/g de chair. Pour déterminer la faisabilité des prétraitements de digestion dans le cadre de la recherche de MP, la filtration puis l’aspect des filtres obtenus ont été évalués. Si la filtration ne s’effectuait pas entièrement, le prétraitement n’était pas considéré comme correct. De plus, même si la filtration se faisait en une seule fois, le filtre était observé visuellement afin de savoir s’il pouvait être exploitable ou non dans le cas d’une recherche de MP.

I.2.2.3.3 Approche 3 : Modification de la concentration du KOH

En se basant sur le travail de Kühn et al. (2017), la concentration du KOH a été augmenté à 3,5 M (essai 5 – Tableau 7). Trois TGI des classes <10 g et [10 – 20 g] ont été utilisés pour ces essais. Pour déterminer la faisabilité de la modification de ce paramètre de digestion dans le cadre de la recherche de MP, la filtration puis l’aspect des filtres obtenus ont été évalués. Si la filtration ne s’effectuait pas entièrement, elle n’était pas considérée correcte. De plus, même si la filtration se faisait en une seule fois, le filtre était observé afin de savoir si il pouvait être exploitable ou non dans le cas d’une recherche de MP.

I.2.2.3.4 Approche 4 : Modification par combinaison des paramètres de digestion

D’autres essais ont été conduits afin d’améliorer la digestion des TGI de merlan. Pour ces différents essais (Essai 6 à 14 – Tableau 7), plusieurs paramètres de digestion incluant le ratio de KOH/g de chair, la concentration de KOH utilisée et la porosité des filtres ont été modifiées. Pour déterminer la faisabilité de la modification de ces différents paramètres de digestion dans le cadre de la recherche de MP, la filtration puis l’aspect des filtres obtenus ont été évalués.

Tableau 7 : Récapitulatif des différents paramètres de digestion des TGI de merlans. La vitesse d’agitation (300 rpm), le temps (24h) et la température d’incubation (60°C) étaient fixes pour tous ces essais.

Essai

Gamme de masse

Traitement

préalable ^{[KOH] Ratio NaW Filtre}

0 - 10 g 10 - 20 g > 20 g Approche 2 1 24h à 150°C 10% - Non GF/A 1,6 µm 2 1 1 0 72h à 60°C 10% 7,15 Oui GF/A 1,6 µm 3 0 2 0 ^{Lyophilisation} 24h ^{10% 7,15 Oui GF/A 1,6 µm} 4 0 1 0 ^{Ajout Tween} 0,05% ^{10% 7,15 Non GF/A 1,6 µm} Approche 3 5 2 1 0 - 3,5 M 7,15 Non GF/A 1,6 µm Approche 4 6 0 2 0 - 10% 14 Non GF/A 1,6 µm 7 1 1 0 - 10% 7,15 Non GF/A 1,6 µm 8 2 0 0 - 10% 14 Non GF/A 1,6 µm 9 1 2 0 - 10% 14 Non GF/A 1,6 µm 10 1 1 1 - 10% 14 Non What - 4 11 2 - 10% 14 Non What - 4 12 3 - 5 M 7,15 Non Tous 13 3 - 5 M 28 Non ^{GF/A 1,6 µm et} Grade 4 14 1 2 - 5 M 28 Non GF/A 1,6 µm