Avant-Propos
Chapitre 2 Développements méthodologiques
Préambule
La recherche de MP dans les différents compartiments de l’environnement marin incluant la surface, la colonne d’eau, les sédiments et le biote a mené à l’émergence d’une multitude de méthode pour échantillonner, extraire, quantifier puis identifier les MP dans ces différentes matrices. Au vu du nombre de méthodes différentes proposé depuis l’émergence de la thématique (Chapitre 1 - Tableau 5), il apparaît que chaque équipe de recherche possède sa propre méthode pour l’analyse des MP dans les organismes.
Malgré les demandes des institutions (Directive Strategy Framework, 2013; OSPAR, 2015 ) et des revues de la littérature appelant à l’harmonisation des méthodes (Lusher et al., 2017b ; Miller et al., 2017 ; Wesch et al., 2016), aucune méthode harmonisée n’existe pour quantifier et caractériser les MP dans les différentes matrices marines, incluant les organismes. Ce manque est problématique car il rend la comparaison entre les différentes études très complexe.
Dans ce contexte, un des premiers objectifs de ce travail a été de réaliser des développements méthodologiques pour extraire et identifier les MP présents dans les produits de la pêche. Dans un premier temps, une méthode pour extraire les MP des tissus des produits de la pêche sans dégrader les MP a été sélectionnée parmi des méthodes trouvées dans la littérature (Article 2)1. Dans un deuxième temps, les limites d’applications de cette méthode ont été déterminées (Article 3)2. Dans un dernier temps, une méthode d’identification des MP par Py-GC/MS a été optimisée, validée et appliquée sur des MP provenant de différentes matrices animales et environnementales (Article 4)3.
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Dehaut, A., Cassone, A.-L., Frère, L., Hermabessiere, L., Himber, C., Rinnert, E., Rivière, G., Lambert, C., Soudant, P., Huvet, A., Duflos, G., Paul-Pont, I., 2016. Microplastics in seafood: Benchmark protocol for their extraction and characterization. Environmental Pollution. 215, 223-233. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.envpol.2016.05.018
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Dehaut A., Hermabessiere L., Himber C., Paul-Pont I., Soudant P., Duflos G., in prep. Study of microplastics in fish whole alimentary tract: Recommendations on the limits of applicability of the KOH digestion method. Environmental Pollution.
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Hermabessiere L., Himber C., Boricaud B., Kazour L., Amara R., Cassone A-L., Laurentie M., Paul-Pont I., Soudant P., Dehaut A., Duflos G., accepted. Optimization, performance and application of a Pyrolysis-GC/MS method for the identification of microplastics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410, 6663-6676. doi : https://doi.org/10.1007/s00216-018-1279-0
I Sélection, optimisation et limites d’un protocole pour extraire les microplastiques des tissus des produits de la pêche
Sélection d’un protocole de digestion des tissus des produits de la pêche I.1
permettant la recherche des microplastiques
I.1.1 Introduction
Cette partie sur l’étude comparative de protocoles permettant l’extraction puis la caractérisation des MP présent dans les produits de la pêche a été valorisée à travers la publication d’un article scientifique dans le journal Environmental Pollution (Article 2) :
Dehaut, A., Cassone, A.-L., Frère, L., Hermabessiere, L., Himber, C., Rinnert, E., Rivière, G., Lambert, C., Soudant, P., Huvet, A., Duflos, G., Paul-Pont, I., 2016. Microplastics in seafood: Benchmark protocol for their extraction and characterization. Environmental Pollution. 215, 223-233. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.envpol.2016.05.018
Ce travail a été réalisé conjointement, entre le Laboratoire de l’environnement Marin (LEMAR), le laboratoire Détection, Capteurs et Mesures (LDCM) de l’Ifremer de Brest, la Direction de l’Evaluation des Risques (DER) et le Laboratoire de Sécurité des Aliments (LSAl) – Département des produits de la pêche et de l’aquaculture de l’Anses dans le cadre du projet Convention de Recherche et Développement (CRD) Microplastiques (2015-CRD-11).
Les objectifs de ce travail étaient de tester (i) six protocoles déjà publiés sur 5 polymères de plastiques (PEBD, PEHD, PP, Polyamide 12 (PA-12), PS) (Expérience 1) (Figure 15), (ii) les effets de trois protocoles retenus sur 15 polymères (PEBD, PEHD, PP, PA-12, PA-6, PC, PET, PMMA, PFTE, PS, PSe, PSXL (Polystyrène cross-linked), uPVC, PUR, AC (Acétate de cellulose)) (Expérience2) (Figure 15). Les effets des protocoles sur les plastiques ont été évalués en photographiant, pesant et identifiant les polymères par Py-GC/MS et spectroscopie µ-Raman avant et après application des protocoles. Pour finir, (iii) la digestion de tissus de produits de la pêche a été testée sur 3 organismes (moule, étrille, daurade grise) avec les deux protocoles retenus pendant l’expérience 2. En parallèle, la récupération de MP dans des tissus de produits de la pêche a été étudiée suite à l’enrichissement artificiel de matrice biologique (tube digestif et filet de poisson) avec des particules de PA-6 (Expérience 3) (Figure 15).
Ce projet initié au début de la thèse m’a permis de participer aux différentes expériences de ce travail. J’ai notamment contribué à la réalisation de l’expérience 1 ainsi qu’à l’expérience 2. Ma contribution a été de réaliser l’évaluation des effets des différents protocoles sur les 15 familles de plastiques en effectuant les mesures photographiques, de pesées et en procédant à l’identification des polymères par Py-GC/MS. De plus, j’ai réalisé l’enrichissement des matrices biologiques de l’expérience 3.
I.1.2 Synthèse des principaux résultats de l’article 2
L’expérience 1 a montré que les protocoles 1, 5 et 6 pouvaient être utilisés pour l’expérience 2 car ceux-ci n’avait pas d’effets délétères sur les polymères utilisés dans cette expériences. Néanmoins, les protocoles utilisant des acides (Protocole 3 : HNO3 65% et protocole 4 : HNO3 65% : HClO4 65 % (4:1 – v:v)) dégradent de manière importante le PA-12 et jaunissent d’autres polymères, notamment le PEBD. De plus, le protocole utilisant la pepsine n’a pas été conservé pour l’expérience 2, c’est-à-dire pour tester ce protocole sur 15 familles de plastiques, car la littérature a montré que la digestion des tissus de poisson est problématique avec cette enzyme.
Les deux protocoles retenus pour l’expérience utilisaient l’hydroxyde de potassium (KOH) 10% et le persulfate de potassium (K2S2O8) 0,27 M : NaOH 0,24 M. Ces deux protocoles ne dégradaient pas les polymères plastiques, à l’exception de l’AC. De plus, ces deux protocoles n’altèraient pas les identifications obtenues en Py-GC/MS et en spectroscopie µ-Raman. L’expérience 2 a montré que le protocole utilisant de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 10 M dissout totalement le PC et dégrade partiellement le PET et l’AC. Ce protocole n’a donc pas été retenu pour l’expérience 3.
L’expérience 3 a montré que le KOH 10% incubé à 60°C pendant 24h est le protocole qui digère le mieux les tissus des organismes marins sans dégrader 14 familles de polymères différentes (Figure 15). Le protocole KOH 10% est le meilleur compromis pour extraire et identifier les MP dans les produits de la pêche. Ce protocole devrait être mis en œuvre dans d'autres études de suivi pour assurer la pertinence et la comparaison des études sur les produits de la pêche.
Figure 15 : Démarche expérimentale de l’analyse comparative de six protocoles en vue de l’extraction et de l’identification des MP des produits de la pêche.
I.1.3 Article 2 : Microplastics in seafood: benchmark protocol for their extraction and characterization