Choix de la cyclodextrine 2.1.2.1
Le choix de la CD a été réalisé par CLHP. Pour cela, nous avons utilisé initialement la colonne 1 et les conditions opératoires décrites par Claude (Claude et al., 2004) soit :
une phase mobile variant dans un rapport de 55/45 v/v à 70/30 v/v
acétonitrile/tampon phosphate (acide phosphorique 20 mM – hydroxyde de sodium 18,9 mM – pH 3,5)
une concentration en cyclodextrine variant de 2 à 12 mM, un débit de 1 mL/min,
une température de 25°C
Les masses de cyclodextrines sont pesées exactement puis dissoutes dans 500 mL de solution tampon à l'aide d'un bain à ultrasons. Les 500 mL d'acétonitrile sont ajoutés à cette solution et la phase mobile totale est mélangée et filtrée.
Ces conditions opératoires de CLHP ne se sont pas montrées optimales et la méthodologie de CLHP a dû être optimisée selon les conditions opératoires suivantes :
une phase 50% acétonitrile, 50% tampon phosphate (v/v). La solution tampon est composée de Na2HPO4, 2H2O à la concentration de 3,56g/L. Son pH est ajusté à 3,0 avec H3PO4. Cette solution tampon est filtrée sur membrane nylon 0,45 µm avant utilisation. la colonne 2 différentes concentrations (0, 1, 2, 3, 4 mM) en CDs (β-CD, HP-β-CD, γ-CD, HP-γ-CD) un débit de 3 mL/min, une température de 50°C
Les solutions échantillons de triterpènes sont préparées à 1 mg/mL dans le méthanol, puis diluées au 10ème dans de la phase mobile sans CD. Elles sont injectées grâce à une boucle de 20 µL.
Chaque soluté a été injecté trois fois et l'acquisition et l'enregistrement des données sont réalisés à l’aide d’un logiciel spécifique.
Les facteurs de capacité correspondants ont été calculés (k’ ± SD). k’ est une grandeur indépendante du débit comme le montre l’Équation 4.
Équation 4 : Définition du facteur de rétention en CLHP.
Avec k’ facteur de capacité
t : temps de rétention du composé étudié
t0 : temps de rétention d’un composé non retenu (ou encore temps mort).
En supposant que chaque molécule de AHPT forme un complexe 1/1 avec la CD (Claude et al., 2004), l’équilibre suivant peut être envisagé :
AHPT + CD APHT-CD
Lorsque la CD est ajoutée à la phase mobile, le facteur de capacité des solutés, est affecté tel que décrit par l’équation 6 pour un complexe 1:1 (Mosheni et Hurtubise, 1990 ; Uekama et al., 1978).
( )
Équation 6 : relation entre k’, k’0 et Kf.
Où :
k’0 est le facteur de capacité sans CD,
[(CD)] est la concentration en CD dans la phase mobile, et Kf est la constante de formation apparente du complexe.
Selon l’Équation 6, le tracé de 1/k’ en fonction [(CD)] est une relation linéaire et reflète un complexe AHPT-CD avec une stœchiométrie 1:1. Le rapport (pente / ordonnée à l’origine) permet :
la détermination de Kf, le choix de la cyclodextrine.
Détermination des constantes de complexation et des paramètres 2.1.2.2
thermodynamiques de formation des complexes acides hydroxy pentacycliques triterpénoiques – gamma-cyclodextrine
Les conditions opératoires précédemment utilisées pour injecter les AHPTs dans différentes conditions de phase liquide, ont été modifiées afin de pouvoir étudier l’influence de la variation de température sur la formation des complexes. En effet, la γ-CD n’étant plus soluble dans la phase mobile acétonitrile/tampon à des températures inférieures à 50°C, l’acétonitrile a dû être remplacé par le méthanol.
Dans ce but, l’appareillage utilisé a permis de faire varier la composition de la phase mobile grâce à une pompe ternaire qui réalise le mélange des trois composants suivants :
Solution tampon phosphate (même composition que précédemment) Méthanol
Le mélange de ces trois composants a permis d’obtenir une phase mobile composée de 88% de méthanol et 12% de tampon phosphate avec une concentration variable de 0 à 4 mM en -CD (0, 1, 2, 3, et 4 mM).
Afin de vérifier qu’une variation du facteur de rétention des AHPTs est liée à un phénomène de complexation avec la -CD et non à l’augmentation de la viscosité de la solution du fait de l’ajout de γ-CD, la γ-CD a été remplacée par l’α D-glucose. Cette vérification n’a été réalisée que pour la plus forte concentration en -CD qui correspond à une concentration de 32,0 mM en α D-glucose.
Le débit de la phase mobile est de 1 mL/min et a été systématiquement contrôlé lors des expérimentations.
Pour étudier l'effet de la température sur le processus de complexation des AHPTs par la γ-CD, la température de la phase stationnaire a varié de 25 +/-1°C à 45 +/-1°C (25, 30, 35, 40, 45°C) à l’aide d’un four à colonne. La colonne est équilibrée avant chaque utilisation et la pression stabilisée est inférieure à 150 bars. Le temps mort de la colonne t0 a été déterminé à l'aide d’une solution de sulfate de cuivre (0,01 mg/mL) comme décrit par Clarot et coll. (Clarot et al., 2001).
Chaque soluté a été injecté trois fois et les facteurs de capacité correspondants (k’) ont été calculés ainsi que les constantes de formation Kf des complexes formés.
Le tracé de k’ en fonction de la température permet d’obtenir des droites dont les pentes et ordonnées à l’origine sont utilisées pour calculer les paramètres thermodynamiques (ΔH0, ΔS0) du phénomène de complexation.
La relation thermodynamique représentée dans l’équation 7 (Mosheni et Hurtubise, 1990) a été employée pour déterminer la variation d’enthalpie standard (ΔH0) et la variation d’entropie standard (ΔS0) qui caractérisent le transfert de l’AHPT de la phase mobile à la cavité de la γ-CD (Clarot et al., 2001).
Où :
Kf est la constante de formation apparente du complexe d'inclusion, R est la constante des gaz parfaits
et T la température exprimée en kelvin (K).
Si l’on trace Ln(Kf) en fonction de 1/T (relation de Van't Hoff), la pente et l’ordonnée à l’origine sont respectivement - H0/R et S0/R.
Pour la détermination de la différence d'énergie libre de Gibbs, qui a lieu pendant le processus d'inclusion, l'équation 8 est utilisée.
ΔG0 = ΔH0-TΔS0
Équation 8 : second principe de la thermodynamique.
ΔG0 : variation d’énergie libre ΔH0 : variation d’enthalpie ΔS0 : variation d’entropie T : température.
Détermination de la solubilité des complexes acides hydroxy 2.1.2.3
pentacycliques triterpénoiques – gamma-cyclodextrine par la méthode de Higuchi-Connors
La méthode de Higuchi et Connors (Higuchi et Connors, 1965) permet de déterminer quel type de complexe est obtenu en fonction de sa solubilité soit :
des complexes d'inclusion solubles : complexe que l’on peut dissoudre avec une dissociation minimum dans un solvant considéré,
des complexes d'inclusion avec une faible solubilité : complexe que l’on peut difficilement dissoudre sans dissociation dans un solvant considéré,
des complexes de solubilité limitée : complexe que l’on ne peut pas dissoudre sans dissociation dans un solvant considéré,
des complexes insolubles : complexe que l’on ne peut pas dissoudre même en les dissociant dans un solvant considéré.
Pour l’étude de solubilité des complexes AHPTs :γ-CD selon cette méthode, le système chromatographique (Tableau XIII) a bénéficié d’un passeur d’échantillons automatique.
La formation des complexes AHPTs : γ-CD a été la suivante :
Étant donné l’insolubilité des AHPTs étudiés en phase aqueuse, ces derniers ont été apportés sous forme solide. Pour ce faire, une masse de 1 mg d'AHPT a été introduite dans chaque tube afin que sa concentration molaire finale soit en excès, ou en équivalence à celle de la γ-CD.
La -CD a été apportée en solution aqueuse à différentes concentrations (de 0 à 8 mM). Tous les tubes ont été complétés avec de l’eau ultra pure afin d’avoir des concentrations toutes identiques en AHPT (2 mM).
Ces suspensions ont été agitées à 30°C pendant 7 jours à l’aide de l’Aerotron à 420 rpm. Une fois l'équilibre atteint, les tubes ont été centrifugés et la concentration en AHPT du surnageant a été déterminée par analyse CLHP. Chaque expérience a été réalisée trois fois (écart type <5%).
Le mode opératoire schématique de cette formation est présenté dans la figure suivante :
Figure 22 : Mode opératoire schématique de la formation en phase aqueuse des complexes en fonction de la concentration en -CD
Ensuite, la courbe représentant la concentration en AHPT en solution en fonction de la concentration en -CD dans la phase aqueuse est tracée. Selon Higuchi et Connors, le type de courbe obtenue donne la solubilité du complexe (Figure 23).
Figure 23 : Les différents types de complexe possibles (Higuchi et Connors, 1965)
Les courbes de type «A» indiquent la formation de complexes d'inclusion solubles. Les courbes de type «A» peuvent se subdiviser en trois catégories :
AL (augmentation linéaire de la solubilité des invités en fonction de la concentration en CD)
AP (augmentation positive de la solubilité des invités en fonction de la concentration en CD)
AN (augmentation négative de la solubilité des invités en fonction de la concentration en CD).
Les courbes de type «B» indiquent la formation de complexes d'inclusion avec une faible solubilité.
Les courbes de type «BS» indiquent la formation de complexes de solubilité limitée Les courbes de type « BI » indiquent la formation de complexes insolubles.